新手带教｜RNA定量、纯度与完整性检查

02实验原理

浓度、纯度和完整性是三个不同问题：RNA HS主要回答有多少RNA；UV比值提示可能的吸收污染物；电泳/芯片图反映长度分布和降解。每种方法都有检测范围、背景和误差。做RT前还需确认目标输入量、无明显抑制物、无严重降解，并安排NoRT/无模板等后续对照。

04材料与仪器

• RNA样本、Qubit RNA HS reagent/buffer/两支标准、塑料混液容器和适配荧光计；每管最终200 μL。
• 可选UV吸收微量分光仪、空白液、低吸附RNase-free管和枪头。
• RNA完整性电泳平台（毛细管芯片或甲醛变性胶）、合适RNA ladder/阳性参考RNA。
• 计时器、冰盒、记录模板、样本留样管；Qubit测后不要把RNA染液反向倒回原液。

05配液与用量

Qubit RNA HS体系，按本品牌说明：试剂以1:200稀释入buffer。若同时做2个标准+4个样本，按6管并额外约1管移液余量计算，配约1.4 mL工作液：7 μL RNA HS reagent+1,393 μL buffer，总量1,400 μL。

本例预计RNA为50 ng/μL，每管2 μL即100 ng，落在RNA HS每管4–200 ng的检测范围内。取样量可在1–20 μL内调整，须先估算浓度并核对范围。所有管室温放置2分钟后读数。

06时间安排

07开始前的准备

先确认RNA没有反复冻融且管内无可见沉淀。Qubit标准恢复至说明书要求温度，轻轻混匀；避免手握 assay tube升温。样本至少留出RT输入和复测余量。若只有2 μL RNA，先算所需输入量与剩余体积，再决定是否做全部可选项目。

08逐步操作

1. 给每份RNA分配唯一编号，核对提取日期、重溶体积、样本用途和冻融次数。
2. 轻柔混匀RNA并短暂离心；根据预计浓度选择Qubit取样体积。本例取2 μL、预计100 ng，需确认总量位于4–200 ng范围内。
3. 新建记录行：Qubit读数、取样体积、浓度单位、RNA总量、UV比值、完整性结果分开填写。
4. 按每管1:200配Qubit RNA HS工作液；本例6管加余量约7 μL试剂+1,393 μL buffer，用干净塑料管混匀。

   

5. 标记两支标准和每支样本管盖。不要只标管侧面，避免影响荧光读数窗口。
6. 每标准加190 μL工作液和10 μL相应标准；每样本加198 μL工作液和2 μL RNA。
7. 每管涡旋3–5秒，盖紧；样本管间更换干净枪头，防止标准或高浓度RNA交叉污染。
8. 室温避光/静置2分钟；所有样本一致计时，超过稳定时间按说明重测。
9. 开机进入RNA High Sensitivity assay，选择重新读取标准；依次插入标准1、标准2并确认仪器识别顺序。
10. 输入样本实际加入体积2 μL及希望的单位，逐管读数；不要误选DNA HS或把取样体积填成总反应体积。
11. 计算总RNA量=原样浓度×可用原液体积；单位ng/μL乘μL等于ng。留出RT、复测与存档份额。
12. 如做UV吸收，先用与RNA重溶完全相同的液体做空白，擦拭测量台，确保液滴不夹气泡。
13. 加样测A260、A280、A230并记录原始谱线和检测浓度范围；低浓度样本比值不稳定时标为“仅供参考”。

    

14. 若做电泳/芯片，按平台要求输入同量RNA和RNA ladder/参考样本；选择适配总RNA的变性体系，不以未变性DNA胶随意代替。
15. 查看高分子rRNA主要峰/带是否清楚、低分子拖尾或碎片是否增加；不同物种、细胞类型及平台峰图外观会不同。

    

16. 取得芯片RIN/RQN等仪器指标时，记录软件版本、样本输入量和原始电泳图；不要手工从概念图估算RIN。
17. 将Qubit、UV、完整性三类结果并排核对。浓度高但电泳严重拖尾时，不能仅凭浓度放行。
18. 放行至表达分析前确认是否完成去DNA：需要时按所选RNase-free DNase的配套buffer、单位和时间处理，随后完成该体系支持的去除/失活及兼容的RNA清理，不把另一品牌的加热条件直接套用。处理后重新测浓度和可用体积，必要时复查完整性；不能沿用处理前浓度算RT输入。随后再按验证范围为各样本统一RNA输入，并安排NoRT与NTC。
19. 记录放行、重提或cleanup理由。若无统一放行阈值，标明“平台/项目标准待确认”，不能伪造通用门槛。
20. 将剩余RNA分装、标记浓度/日期后放回经验证低温环境，登记冻融次数。

09结果判断与质控

Qubit RNA HS给出的是其校准算法对原RNA样本的估计浓度；本例技术文件指出对应 assay总量窗口约4–200 ng，超范围需改变取样量或选择另一适配方法。UV谱峰应看原始曲线而非只看比值；低浓度RNA不能用吸收比做强结论。完整性示意图只解释条带/峰形概念，不是仪器截图或模拟RIN。任何放行阈值须来自项目验证、样本类型和下游应用。

10实验记录模板

11常见问题与排错

Qubit标准不通过或样本不重复

检查标准顺序、工作液比例、涡旋/孵育、输入体积、管外污渍/指纹及assay类型；换新标准重新校准。

Qubit显著低于UV

UV可能受DNA、游离核苷酸或污染吸收影响；检查空白与样本浓度，优先用适配荧光定量估算RNA。

A260/230偏低

可能有酚、胍盐或盐残留；考虑cleanup并复测，同时关注下游RT抑制。

完整性图异常

先查参考RNA、上样量、芯片/胶操作和样本放置时间；确认异常后考虑重提。RIN数值必须来自适配平台，不能凭肉眼猜。

12参考资料

• Thermo Fisher, *Qubit RNA HS Assay User Guide*, Rev B.0, physical pp.1, 4–5；本文限RNA HS配置与所述体积。
• 本站原创判断流程和概念图；没有捏造RIN或实测光谱。完整依据见 beginner-source-review.md。