新手带教｜qPCR四倍稀释标准曲线与扩增效率

02实验原理

Cq通常随模板输入的log10减少而线性增加。斜率理想值约−3.32对应每循环约一倍扩增；效率从斜率换算。只看R²高并不足够：点数/范围、NTC、熔解特异性、重复一致性和低端检出都要检查。普通2^-ΔΔCq比较需要目标与内参效率在可比范围内。

04材料与仪器

• 已验证可扩增的cDNA参考池，低浓度无核酸酶水或与样品匹配的稀释液。
• Power SYBR 2×Mix、同一目标引物10 μM、光学板与膜、ABI7500 Standard。
• 低吸附管、P20/P200、滤芯枪头、冰盒、涡旋/短离心设备。
• 稀释记录表和预先设定的最低接受标准；阳性参考样本与NTC。

05配液与用量

两基因每基因18孔（5点×3+NTC×3），按20份配360 μL master mix：200 μL 2×Mix、12 μL每条10 μM引物、136 μL水。每孔18 μL mix+2 μL稀释模板/NTC水。

06时间安排

07开始前的准备

D0至少准备80 μL以上，以便取20 μL配下一稀释、上三复孔6 μL并留移液余量。每级预先标记，工作台按D0到D4顺序排放。D4低拷贝端易受非特异/随机性影响。若参考池不足，不要减少下级体积却沿用原计算；重算并记录实际比例。

08逐步操作

1. 选择已确认含目标转录本的cDNA参考池，先确认目标扩增区和物种/引物一致。
2. 设计D0-D4、NTC和孔位图，每个浓度三技术复孔。两个目标基因分开配引物和反应mix。
3. 标记五支低吸附稀释管和NTC管；准备独立枪头盒，避免拿着同一枪头在多级间回吸。
4. 按计划配D0为1:5 cDNA稀释液并轻混；记录原液浓度或RNA等效输入、稀释液和日期。
5. 各D1-D4管先加入60 μL稀释液，盖好后再加入20 μL上一级液体，形成80 μL总量。
6. 每次转移使用新枪头，加入后涡旋短混或至少缓慢吹吸8–10次，再短暂离心收液。

   

7. D0-D4全部完成后，从最低浓度D4开始检查管盖编号，再核对相邻稀释关系，避免拿错级别。
8. 每基因算18个实际孔，按20孔余量配360 μL master mix：200 μL 2×Mix+12 μL正引物+12 μL反引物+136 μL水。
9. 每孔分装18 μL对应基因mix；不同基因使用不同枪头和独立区域。
10. D4至D0依次向三复孔各加2 μL模板，减少高浓度端滴落污染低浓度端。NTC加2 μL水。
11. 每一级更换枪头，模板液慢慢落入孔底；不可让枪头接触孔口或邻孔。
12. 封膜、轻混并短暂板离心，检查气泡、液量和孔位。把每级三孔放在易检查的相邻位置。
13. ABI7500 Standard设置SYBR/ROX、20 μL、95°C10分钟及40×95°C15秒/60°C1分钟，熔解程序按体系和本机文档设置。
14. 上机时确认各孔样本名携带D0-D4级别，避免软件导出后失去稀释信息。
15. 用同一基线/阈值算法计算Cq，去除孔只能依据事先定义的技术原因并保留原始值和理由。
16. 设置x=log10相对输入（1、1/4、1/16、1/64、1/256），y=Cq，线性回归Cq=slope×x+intercept。
17. 扩增效率E=(10^(−1/slope)−1)×100%；记录斜率、R²、置信范围（若软件提供）及技术复孔离散度。

    

18. 检查NTC是否无扩增/无目标熔解峰；若有晚峰，判断是否引物二聚体或污染并按预设门槛处理。
19. 检查五点是否均在可靠检出范围内、趋势单调、重复一致；只保留线性段时需说明低端/高端排除理由。

    

20. 将每个引物对的标准曲线文件、孔图、稀释计算、效率与熔解结果归档；没有通过验证的引物不用于定量结论。

09结果判断与质控

模拟理想数据：相对输入1、0.25、0.0625、0.015625、0.00390625；Cq 20、22、24、26、28。回归斜率约−3.3219，效率100%，R²=1.000（因示例无噪声）。真实实验不可能因此自动达到R²=1。图内和图注写“教学模拟，非实验数据”。

10实验记录模板

11常见问题与排错

效率过高

检查稀释级间交叉污染、低端非特异扩增、基线阈值、引物二聚体及D0配制；不通过删除异常点美化效率。

效率过低

检查PCR抑制物、引物设计/浓度、退火条件、扩增长度及稀释混匀；用匹配模板排查。

R²高但NTC也扩增

标准曲线不能证明特异性；先处理污染/二聚体问题，再独立重复。

三复孔分散

查移液器校准、孔底气泡、低拷贝随机分配、封板和板离心，逐级混合。必要时扩大每孔体积或重配梯度。

12参考资料

• Applied Biosystems, *Power SYBR Green PCR Master Mix User Guide*，前轮取得的官方46页PDF。
• 斜率效率公式按标准qPCR定义；模拟数据由本站脚本生成，注明“教学模拟，非实验数据”。参数和准入边界见 beginner-source-review.md。