01本篇适用条件
使用指导者提供的1.5 mL新鲜大肠杆菌K-12 MG1655液体培养物，OD600约1–2；同时处理1管不含细胞的TE提取空白。此处为革兰阴性BSL1实验室株的基因组DNA路线，不把它外推到酵母、革兰阳性菌或未知环境分离物。最终以100 μL TE重溶；供常规PCR和酶切教学，不保证长读长测序所需的超长片段。
02实验原理
SDS和蛋白酶K破坏膜及蛋白，高盐条件下CTAB有助于分离多糖等杂质，DNA保留于水相，随后以异丙醇沉淀。CTAB步骤必须同时考虑盐浓度，不能把旧页“8 μL CTAB”和未注明浓度的溶菌酶照抄为通用配方。本例不需另加溶菌酶；不把裂解后的混浊度当作DNA产量。
03安全与适用范围
穿实验服、护目镜并戴与SDS相容的手套；酚、氯仿均须由受训指导者在化学通风橱内带教，使用密封耐溶剂管，发生皮肤接触立即按本单位应急流程处理。含卤有机相、界面和污染枪头分别进入规定化学废物容器，不倒入水槽、不与漂白剂混合；乙醇及异丙醇远离火源。离心管和转子须适配所列×g，配平后运行，不把rpm直接视为×g。
04材料与仪器
- 1.5 mL已鉴定K-12培养物、TE、10% SDS、20 mg/mL蛋白酶K、DNase-free 10 mg/mL RNase A。
- 5 M NaCl，10% CTAB/0.7 M NaCl，pH8酚:氯仿:异戊醇25:24:1（PCI）、氯仿:异戊醇24:1，异丙醇，70%乙醇。
- 2 mL耐溶剂管、宽口枪头、37°C及65°C温控装置、可达12000×g的离心机、DNA荧光定量设备、0.8%琼脂糖胶。
05配液与用量
| 配液/项目 | 配方或每管量 | 复核 |
|---|---|---|
| TE 10 mL | 1 M Tris-HCl pH8.0 100 μL、0.5 M EDTA pH8.0 20 μL，水补至10 mL | 10 mM/1 mM |
| CTAB/NaCl 10 mL | CTAB 1.00 g、5 M NaCl 1.40 mL，水补至10 mL；温热溶解 | 10%质量/体积、0.7 M；冷却析出须温热至澄清 |
| 裂解体系 | TE 567 μL、10% SDS 30 μL、20 mg/mL蛋白酶K 3 μL | 总600 μL；SDS 0.5%，蛋白酶K 100 μg/mL |
| 去RNA | 10 mg/mL RNase A 3 μL | 总603 μL，约49.8 μg/mL |
| 高盐CTAB | 5 M NaCl 100 μL，再加CTAB/NaCl 80 μL | 总783 μL；NaCl约(500+56)/783=0.710 M；CTAB约1.02% |
| 抽提 | PCI与783 μL水相等体积，再做等体积氯仿:异戊醇 | 用2 mL管；回收水相量须实测 |
| 沉淀/洗/重溶 | 异丙醇1V；70%乙醇1 mL；TE100 μL | 如水相600 μL，则异丙醇600 μL；不另加盐 |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| 收菌、重悬 | 6000×g、室温 | 10分钟 |
| 蛋白消化/去RNA | 37°C | 60+30分钟 |
| CTAB与抽提 | 65°C 10分钟，离心室温 | 约35分钟 |
| 沉淀、洗涤和风干 | 室温 | 35–45分钟 |
| 重溶 | 4°C | 过夜 |
07开始前的准备
先核对株名和培养物OD600，准备提取空白B与样本S，所有加量两管同步。CTAB试剂65°C温热至澄清再取样；检查2 mL管可容纳783+783=1566 μL抽提体系。温控管始终盖紧，不采用旧文“65°C打开盖子挥发乙醇”的建议。
08逐步操作
- 将1.5 mL K-12培养物置S管，6000×g离心5分钟，小心吸去培养基；B管从下一步开始同步加液。
- 向沉淀及B管各加567 μL TE，S充分重悬至无可见菌块；此时可温和吹打，裂解后改用宽口头。
- 各加30 μL 10% SDS和3 μL 20 mg/mL蛋白酶K，盖紧，缓慢颠倒10次。
- 37°C孵育60分钟，每15分钟轻颠倒一次，记录是否变清及黏稠；不涡旋已释放的基因组DNA。
- 各加3 μL RNase A，37°C继续30分钟；记录RNase是否为DNase-free。
- 各加100 μL 5 M NaCl，颠倒充分混匀，再加入80 μL已澄清CTAB/NaCl液。
- 盖紧，65°C孵育10分钟，取出冷却至室温。
- 在通风橱中各加入783 μL pH8 PCI，盖紧，缓慢颠倒约2分钟；不让液体接触管盖外侧。
- 12000×g、室温离心10分钟；将上层水相移入新管，避开界面，记录实得水相V。
- 按该V加入等体积氯仿:异戊醇，颠倒2分钟，12000×g室温离心10分钟；取上层水相记录最终V，仍混浊则重复该步。
- 加入1V室温异丙醇，轻颠倒至均一，室温放10分钟；12000×g离心15分钟。
- 标记沉淀所在外侧，缓慢吸去上清；沿对侧壁加入1 mL 70%乙醇，12000×g离心5分钟后吸尽洗液。
- 室温开盖风干5–10分钟至无可见液滴，加100 μL TE，轻弹管壁，4°C过夜重溶；不用65°C开盖蒸干。
- 用相同荧光法定量S和B，取约100 ng S做0.8%胶完整性检查，记录高分子量带、拖尾和空白；分装−20°C保存。
09结果判断与质控
S应有可定量DNA，B不应出现与S相当的DNA信号；胶中以高分子量DNA为主，无大量低分子RNA。产量随菌量变化，不承诺旧页3–5 μg。若下游PCR失败，先用稀释模板和已知可扩增DNA分辨抑制，不以A260/280单个比值认定纯度。
10实验记录模板
| 管号/株名 | OD600/菌液mL | CTAB澄清/盐量 | 水相V μL | 异丙醇1V μL | 重溶μL | ng/μL/总μg | 胶/空白 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| S/B | 待填 | 100/80 μL | 待测 | 待算 | 100 | 待测 | 待填 |
11常见问题与排错
水相黏稠难移
用宽口枪头，减少剪切；不要增加菌量或强涡旋。界面过厚时重复抽提。
沉淀难溶
检查过度风干及CTAB/盐残留，延长4°C浸泡；不把未溶杂质算作DNA。
PCR受抑制
检查CTAB、盐及溶剂夹带，以1:10模板稀释和独立阳性对照定位；严重夹带须重新净化。
12参考资料
- 用户提供《分子生物学实验手册 来源网络仅供参考》物理第6页：核对SDS、CTAB和沉淀历史路线；弃用8 μL CTAB和含糊蛋白酶K参数。
- 昆士兰大学Australian Centre for Ecogenomics，Willner等，Comparison of DNA Extraction Methods for Microbial Community Profiling with an Application to Pediatric Bronchoalveolar Lavage Samples，PLoS ONE 2012，Methods/CTAB protocol：实际全文核对567 μL TE、30 μL10%SDS、3 μL20 mg/mL蛋白酶K、100 μL5 M盐及80 μL CTAB/NaCl；本文仅采用其化学配方交叉核对，样本限定K-12，不采用临床样本与取材。
- Addgene，Purifying Plasmid DNA，查阅2026-11-02：核对水相/有机相、氯仿去酚及醇沉淀。本文另加RNase步骤、65°C10分钟、明确×g及旧页1倍异丙醇为限定教学设置；菌量和产率须实际质控。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。