Annexin V/PI 凋亡流式：漂浮细胞、单染补偿和四象限

02实验原理

凋亡细胞可能先漂浮，若倒掉培养上清会系统性低估阳性。每组把上清、一次洗液和温和解离后的细胞合并，再洗入含钙的1×结合缓冲液。染色后不固定、不透化、不用含EDTA的PBS代替结合液。先设置未染、两种单染，再分析双染样本。

04材料与仪器

V13241套装；HeLa每样本至少约2×10⁵可收获细胞；冷PBS、完全培养基、已验证温和解离液、5mL流式管；488nm流式仪及合适的绿色/PI探测器。准备未染、Annexin单染、PI单染、双染阴性及双染阳性样本。

05配液与用量

阳性候选在37°C处理4小时仅用于预实验，不能保证HeLa全部变为早期凋亡。PI单染用可可靠产生PI阳性的受损细胞材料；不能用全阴性细胞计算不存在的串色信号。

06时间安排

07开始前的准备

以6孔板每孔2mL为收集示例，先留够单染和未染用细胞。阳性候选孔换入2mL上表1µM星形孢菌素液，载体孔换入2mL等量DMSO培养液，37°C/5%CO₂同步处理4小时；终点全部培养上清均保留收集。预设每样本至少收集1万个单细胞事件，教学目标2万，记录真实达到数；不能只采集固定总事件却包含大量碎片。验证仪器电压、激光和补偿，将载体组及处理组使用相同门与设置。

08逐步操作

1. 显微拍照记录每孔贴壁和漂浮状态，不先倒掉旧液；将2mL培养上清完整转入对应离心管。
2. 沿孔壁加1mL冷PBS轻洗一次，将洗液合并到同组上清；洗液不跨组共用。
3. 用已验证的温和解离方法收取贴壁细胞；教学可用ATCC胰酶250µL短时解离，见松动即以1mL完全培养基终止，不按固定长时间强行消化。
4. 将解离细胞与原上清合并，室温200×g离心5分钟，弃上清，加入1mL冷PBS轻柔重悬；再重复离心洗一次，去除血清和残余解离成分。
5. 取独立样本计数，用套装1×结合液将细胞调整到约1×10⁶/mL，不加EDTA；每管取100µL。
6. 未染管只加相应结合液；Annexin单染加5µL Annexin而不加PI；PI单染只加1µL PI工作液，补液使单染反应体积与双染一致。
7. 双染管加入5µL Annexin原液和1µL 100µg/mL PI工作液，轻柔混匀；室温避光15分钟，不在37°C延长染色。
8. 每管加入400µL1×结合液，轻混并置冰上，记录结束时间；按说明尽快上机，本例不设长时间储存窗口。
9. 先用未染和两种单染设基线与补偿，检查阳性单染足够明亮且未饱和；不能用处理组双染图“调到四象限好看”。
10. 依次设细胞群、单细胞门并保留低散射群检查，避免把所有缩小的凋亡细胞当碎片删除；采集约2万单细胞事件。
11. 用一致象限线计算Annexin−/PI−、Annexin+/PI−、双阳性、Annexin−/PI+比例，保存原始FCS、门图和补偿矩阵。
12. 各独立批次分别汇总，结合形态或caspase等终点解释；报告早期样与双阳性状态，不自动把双阳性全部命名坏死或晚期凋亡。

09结果判断与质控

示例单细胞门内2万事件，Annexin+/PI−为3000、双阳性2000，则早期样15%、双阳性10%、两者合计25%。分母必须是同一门中的全部合格事件；丢掉漂浮细胞或任意排除低散射群都会改变比例。

10实验记录模板

11常见问题与排错

所有样本PI很高：查解离损伤、延迟上机和样本原状态。Annexin信号全低：查是否误用无钙缓冲液、残余EDTA和试剂保存。补偿后出现斜带：重查单染和亮度，不手动移动象限掩盖串色。

12参考资料

• Invitrogen：V13241官方使用手册，MAN0002108，已读取5×液1:5、PI工作液、100µL样本+5µL Annexin+1µL PI、15分钟及400µL后稀释。
• ATCC：HeLa CCL-2。HeLa收集参数、事件目标和阳性处理为教学候选，未声称厂家针对该株验证。