硫酸铵分级沉淀：10 mL教学蛋白液的0–30%与30–60%分段

02实验原理

高盐竞争水化使不同蛋白在不同盐饱和度沉淀。饱和百分数是相对于指定温度的饱和液，不是质量体积百分浓度。用饱和液加量公式V加=V原×(S终−S初)/(1−S终)，本式以饱和分数和近似体积加和为教学计算。

04材料与仪器

10 mL蛋白样本、同温100%饱和硫酸铵澄清液至少30 mL（储液最终也含50 mM Tris-HCl，4°C校正pH7.5）、50 mM Tris-HCl pH7.5、50 mL离心管、小烧杯/搅拌子、4°C冷室、可设10000×g的冷冻离心机、透析器、适合去盐后蛋白定量/SDS-PAGE。

05配液与用量

饱和储液由受训人员制备：使储液最终含50 mM Tris-HCl、4°C时pH7.5，在4°C加入过量硫酸铵至持续残余晶体，平衡过夜后取澄清上清并记录温度、缓冲组成和pH。调整缓冲液或pH后必须在4°C重新与过量硫酸铵平衡，确认仍为饱和液。不能把无缓冲饱和盐水或室温饱和液当作本储液。样本与盐储液均为50 mM缓冲，混合后不会因加盐储液而把缓冲浓度降到35或20 mM。

06时间安排

07开始前的准备

记录输入并另取小份作输入检测，主实验保留10 mL。预标P0–30、S30、P30–60、S60；所有组分保留。蛋白定量可能被盐干扰，原样与各分段必须换入相同基液后比较。第二段加量依据第一段实际回收上清，不用理论值替代实测。

08逐步操作

1. 检查蛋白样本清澈且无明显沉淀，记录10.00 mL体积、输入浓度、基液和目标检测方式。
2. 将样本、饱和硫酸铵储液和离心转子预冷至4°C，确认储液澄清，标签注明最终50 mM Tris-HCl、4°C pH7.5及同温饱和状态；不符合则停止并请指导者重配。
3. 量取4.286 mL同温饱和液，分次缓慢滴入10 mL样本，轻搅15–20分钟，不产生大量泡沫。
4. 加完继续4°C轻搅30分钟，让盐浓度均匀且沉淀充分形成；记录浑浊出现时间。
5. 把全液移入适用离心管，对称配平，10000×g、4°C离心20分钟。
6. 小心把上清移入标记S30的管，保留P0–30沉淀；实测上清体积V₁。
7. 按0.75×V₁量取饱和液，15–20分钟滴入S30，4°C轻搅混匀。
8. 第二段加完再4°C轻搅30分钟，记录是否有新的絮状或微细沉淀。
9. 10000×g、4°C离心20分钟，分别保留P30–60沉淀及实测体积的S60上清。
10. 两份沉淀各用1.00 mL不含硫酸铵的基液温和重悬，冰上放15分钟；记录实际溶解体积与未溶物。
11. 两份重溶液及S60取等输入比例小份，分别透析到相同基液，再测总蛋白、目标条带或活性。
12. 计算各段体积×浓度、总质量平衡及目标活性分布；保留含目标且质量可接受的分段作后续纯化。
13. 冷藏短期使用并记录后续去盐、保存条件，按本地要求处理高盐废液。

09结果判断与质控

报告每段实际回收与目标分布，不把出现沉淀等同纯化成功。分段总质量偏离输入需查体积损失、盐干扰和未溶蛋白；活性回收与总蛋白回收分开计算。

10实验记录模板

11常见问题与排错

全无沉淀：核对温度、饱和液状态及蛋白浓度，不能临时凭感觉加盐后仍标30%。沉淀难溶：温和浸泡并保留残渣，检查pH与目标稳定性。回收超过100%：优先查高盐检测干扰、空白及体积加和近似。

12参考资料

旧来源：网络手册物理170–172页。现代核对：NIH/NIAMS Protein Expression Laboratory，Wingfield，Protein precipitation using ammonium sulfate，Current Protocols 2001/开放作者稿2016，查阅2026-11-02，实际核对按饱和液体积加量公式、温度依赖与至少50 mM缓冲；故基液选50 mM Tris，避免铵盐酸化。本文使用同温饱和液进行可复算小试，替换旧文混淆饱和浓度、未明确加盐量与危险调pH建议；不宣称分段区间具有通用选择性。