01本篇适用条件
处理1.5 mL携带3–8 kb高拷贝、无害教学质粒的BSL1 DH5α过夜培养液，另做不含细菌的试剂空白。最终50 μL TE重溶；用于常规酶切和PCR，不作为转染、内毒素控制或超大质粒制备方案。示例质粒AmpR，培养为2 mL LB含氨苄青霉素100 μg/mL。
02实验原理
SDS/NaOH破坏细胞并使DNA和蛋白变性，中和时质粒较易恢复可溶状态，而染色体DNA及SDS/蛋白复合物沉淀。裂解后强混会把染色体剪成可溶碎片，进入质粒水相；因此重悬须彻底，而裂解后只颠倒。
03安全与适用范围
穿实验服、护目镜并戴与SDS相容的手套；酚、氯仿均须由受训指导者在化学通风橱内带教，使用密封耐溶剂管，发生皮肤接触立即按本单位应急流程处理。含卤有机相、界面和污染枪头分别进入规定化学废物容器，不倒入水槽、不与漂白剂混合；乙醇及异丙醇远离火源。离心管和转子须适配所列×g，配平后运行，不把rpm直接视为×g。
04材料与仪器
- DH5α高拷贝教学质粒培养液及空白、溶液I/II/III、RNase A2 mg/mL（DNase-free）、pH8 PCI与氯仿:异戊醇。
- 无水/70%乙醇、TE、耐溶剂管、过滤头、12000–16000×g离心机、37°C温控、定量设备及1%胶。
05配液与用量
| 试剂 | 配方 | 复核 |
|---|---|---|
| 溶液I 10 mL | 1 M葡萄糖500 μL、1 M Tris pH8.0 250 μL、0.5 M EDTA200 μL，水至10 mL | 50/25/10 mM，4°C |
| 溶液II 10 mL，现配 | 1 M NaOH2 mL、10% SDS1 mL、水7 mL | 0.2 M NaOH、1% SDS |
| 溶液III 10 mL | 5 M乙酸钾6 mL、冰乙酸1.15 mL、水2.85 mL | K⁺3 M；由受训者配、核对pH约4.8，不能称总乙酸3 M |
| 每管裂解 | I100 μL、II200 μL、III150 μL | 中和后450 μL |
| RNase | 清上清约350 μL+2 mg/mL RNase5 μL | 10 μg，37°C5分钟 |
| 抽提与沉淀 | PCI等体积；氯仿等体积；最终水相V+2.5V乙醇 | 上清已高盐，不重复加乙酸钠 |
| 洗/重溶 | 70%乙醇500 μL×2，TE50 μL | 若V=300 μL，加乙醇750 μL |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| 培养 | 2 mL选择性LB，37°C振荡 | 12–16小时 |
| 裂解中和 | 冰上，限时 | 15分钟 |
| 澄清/RNase/抽提 | 室温离心、37°C | 30分钟 |
| 沉淀/洗/重溶 | −20°C30分钟，4°C离心 | 约1小时 |
07开始前的准备
以单菌落培养，记录株、质粒和抗性；2 mL LB中加100 mg/mL氨苄2 μL得100 μg/mL（基液先配至1.998 mL）。确认溶液II澄清且现配，不能使用低温析出SDS液而不复溶。每个计时器准备好，不因等别的样本延长碱裂解。
08逐步操作
- 取1.5 mL培养液，8000×g室温离心1分钟，吸去上清，记录培养量；空白管并行加试剂。
- 各加100 μL冷溶液I，样本充分吹打或涡旋直到无菌团。
- 加200 μL新鲜溶液II，立即温和颠倒5次，记开始时间，不再涡旋。
- 冰上放3分钟，观察变清黏稠；总碱处理不超过5分钟。
- 加150 μL冷溶液III，立即颠倒8–10次至白絮均匀，冰上5分钟。
- 12000×g离心5分钟，取约350 μL清上清至新管，避开所有絮状物，记V。
- 加5 μL2 mg/mL RNase A，37°C孵育5分钟；记录RNase批次及有无DNase-free标识。
- 在通风橱加等体积PCI，短混30秒，12000×g室温离心5分钟，移上层水相并记录V。
- 加等体积氯仿:异戊醇，混30秒，同条件离心5分钟，取清水相记录最终V。
- 加2.5V无水乙醇，轻颠倒，−20°C30分钟；16000×g、4°C离心20分钟。
- 吸去上清，500 μL70%乙醇洗沉淀，16000×g离心5分钟；重复一次并吸尽残液。
- 室温风干5–10分钟至无液滴，加入50 μL TE，放15分钟后轻混重溶。
- 同法定量样本和空白，取200 ng做已知单切酶鉴定，另跑未切对照；用线性条带核对大小。
- 记录产量、空白、切割完整性，分装−20°C；不按未切超螺旋迁移率直接估算质粒kb。
09结果判断与质控
未切质粒可有超螺旋、开环等多条带；单切后应为设计全长线性带。可切性和空白清洁比“每mL必得3–5 μg”更可靠。高分子DNA拖尾、RNA小带或酶切受抑均需排查。
10实验记录模板
| 株/质粒/抗性 | 菌液mL | 裂解起止 | 上清/抽提V μL | 乙醇2.5V | 重溶μL/浓度 | 未切/单切/空白 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 1.5 | 待填 | 待填 | 待算 | 50/待测 | 待填 |
11常见问题与排错
染色体污染
查碱裂解后涡旋、超时或絮状物夹带，重新小量温和提取。
质粒不切
查残余乙醇、酚和盐；以已知质粒加同酶对照定位。
RNA多
核对RNase活性、加入阶段与时间；不要把A260高当作质粒高产。
12参考资料
- 用户提供网络手册物理第42–46页；短版物理第7页及第8页开头续文：核对100/200/150 μL体系与醇沉淀，纠正混杂的大量培养条件及“蛋白/染色体不变性”等表述。
- Addgene，Purifying Plasmid DNA，Kit-free Alkaline Lysis Plasmid Miniprep、Phenol-Chloroform Extraction、Ethanol Precipitation，全文查阅2026-11-02：核对三液组成、颠倒不涡旋、RNase与有机抽提；本文限3分钟碱处理及明确×g。
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做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。