01本篇适用条件
仅处理合法取得、已固定包埋的普通非感染性小鼠组织4–6 μm带电玻片，不含动物处置或取材。使用Promega DeadEnd Fluorometric TUNEL System G3250，组织有效面积≤5 cm²，每片取50 μL反应液。最少样本相邻两片、无TdT一片、DNase阳性一片；TUNEL检测DNA断裂，不能单独证明细胞发生凋亡。
02实验原理
rTdT在DNA末端掺入荧光核苷酸。DNase处理验证反应/通透能力，无TdT对照评价非酶背景；过度消化、坏死或处理损伤也能增加信号，需结合形态和独立证据。
原图明确针对贴壁细胞，显示DNA末端标记前后的顺序与对照意识。本篇为组织切片路线，不能照搬图中的细胞固定或通透参数；组织预处理、DNase阳性及无TdT阴性按正文执行。来源为Promega技术手册，非商业推广。
03安全与适用范围
需完成组织化学培训；二甲苯、甲醛在通风橱操作，易燃溶剂远离热源。该套装Equilibration Buffer含砷相关cacodylate和钴盐，按SDS收集专用化学废物，不倒入下水。戴手套、护目镜，DNase阳性使用独立染色缸。
04材料与仪器
- G3250、4%无甲醇甲醛/PFA即用液、二甲苯、无水乙醇、PBS、0.85%NaCl。
- RQ1 DNase M6101（1 U/μL）、Tris/NaCl/MgCl₂/CaCl₂及套装Proteinase K。
- 湿盒、37°C温箱、独立40 mL染缸、塑料盖片、带DAPI的即用抗淬灭封片剂、荧光显微镜。
05配液与用量
| 液体 | 配制 | 用量/浓度 |
|---|---|---|
| 各40 mL梯度乙醇 | 无水乙醇40/38/34/28/20 mL，各补水至40 mL | 100/95/85/70/50% |
| 蛋白酶工作液 | 10 mg/mL储备2 μL+PBS998 μL | 20 μg/mL；每片100 μL |
| 三片含TdT用混液 | Equilibration Buffer180 μL+Nucleotide Mix20 μL+rTdT4 μL | 共204 μL，每片只取50 μL，余量54 μL |
| 无TdT混液 | Buffer45+Nucleotide5+水1 μL | 总51 μL，取50 μL |
| 2×SSC40 mL | 20×SSC4 mL+水36 mL | 终止15分钟 |
| DNase缓冲液10 mL | 1 M Tris pH7.9 400、5 M NaCl20、1 M MgCl₂60、1 M CaCl₂100、水9420 μL | 40/10/6/10 mM |
| DNase阳性液 | 1 U/μL DNase10 μL+上述缓冲990 μL | 10 U/mL，每片100 μL |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| 脱蜡/复水 | 室温，各独立浴 | 约35分钟 |
| 初次再固定 | 4%甲醛、室温 | 15分钟 |
| 蛋白酶/再固定 | 室温 | 8–10分钟/5分钟 |
| DNase阳性 | 室温、独立缸 | 10分钟 |
| 平衡/TdT | 室温5–10分钟/37°C避光60分钟 | 约70分钟 |
| 终止/洗涤 | 2×SSC15分钟，PBS3×5分钟 | 30分钟 |
07开始前的准备
核对组织来源、固定时间、切片厚度和带电玻片附着良好。按瓶签复溶10 mg Proteinase K至1 mL手册缓冲液（100 mM Tris pH8、50 mM EDTA），得10 mg/mL并分装；不把该缓冲与DNase缓冲混用。Nucleotide Mix及TdT混液避光冰上。各染浴40 mL应完全覆盖组织，阳性后续全部使用独立容器。
08逐步操作
- 标记两片样本、无TdT和DNase阳性，记录相邻切片顺序；设置同批未染色片评估组织自发荧光。
- 在通风橱以新二甲苯40 mL脱蜡5分钟，换新液再5分钟；随后100%乙醇40 mL洗5分钟。
- 依次在100%、95%、85%、70%、50%乙醇各40 mL中3分钟，0.85%NaCl40 mL5分钟，再PBS40 mL5分钟。复水后组织不再晾干。
- 4%无甲醇甲醛/PFA中室温再固定15分钟，PBS洗5分钟两次，保持组织附着。
- 每片加100 μL、20 μg/mL Proteinase K，室温8–10分钟；厚度或固定不同需先小试，出现脱片或结构破坏即停，不无限延长消化。
- PBS洗5分钟，4%甲醛再固定5分钟，再PBS洗5分钟。此再固定步骤不以高温抗原修复替代。
- 仅阳性片先加100 μL DNase缓冲室温5分钟，去液后加100 μL、10 U/mL DNase液10分钟；在专用缸用新水充分洗3–4次，避免DNase污染其他片。
- 各片组织加100 μL Equilibration Buffer，室温5–10分钟。同时按表冰上配含TdT与无TdT混液；51 μL是配方和，不是每片必须上51 μL。
- 吸去组织周围多余平衡液，不触组织；样本与阳性各加50 μL含TdT混液，无TdT片加50 μL对应无酶混液，盖塑料片均匀铺开。
- 放湿盒37°C避光60分钟，湿盒底加水保持湿度，不能让组织边缘干涸。面积>5 cm²应同比增加所有相关反应量并验证。
- 去塑料片，将各片放2×SSC40 mL室温15分钟终止，阳性独立缸；再PBS每次40 mL洗5分钟，共3次。
- 加约25 μL带DAPI的即用抗淬灭封片剂并盖玻片，避免气泡压住组织，按该封片剂要求静置后尽快成像。
- 先用阴性/未染片确定背景及统一曝光，检查DNase阳性有核内绿信号，样本用相同参数拍绿通道和DAPI；避免只选择最亮视野。
- 预先规定连续或随机取视野和分割规则，报告TUNEL阳性核/总有效核，并保留组织形态、对照及全视野图；对照失败或大片脱片不报告比例。
09结果判断与质控
DNase阳性和无TdT背景均合格后，才解释样本DNA断裂信号。核外碎屑、折叠、边缘干燥及自发荧光需剔除并记录理由。应结合核形态、caspase相关证据等判断死亡机制，禁止把“TUNEL阳性率”等同于已确定的凋亡率。
完整保留原Figure 2 A/B及刻度，比较处理前后DNA分布；这是HL-60悬浮细胞流式结果，不是本篇组织显微TUNEL结果，DNA含量图本身不能证明断裂标记特异性。
完整保留原Figure 3 A/B、DNA含量与DNA断裂信号双轴及刻度；无TdT对照说明标记酶依赖背景。悬浮细胞流式与组织切片显微读数不同，不能将该图门限或细胞周期比例当作本篇结果。
10实验记录模板
| 组织/来源编号 | 厚度/固定时间 | 蛋白酶min | TdT批次/实际反应 | 阳性/无TdT | 视野规则/有效核数 | 阳性核数 | 图像/曝光 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 4–6 μm/待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
全片强绿
查过度消化、DNase交叉污染、自发荧光及干燥，不直接认定大量凋亡。
DNase阳性也无信号
查DNase活性、通透、TdT反应、温度和光漂白，本批不放行。
组织脱落
查玻片附着和消化时长，优化固定/消化后重做，不仅统计残存片段。
12参考资料
- Promega DeadEnd Fluorometric TUNEL TB235：已读组织预处理、45+5+1 μL混液、50 μL实际反应、37°C60分钟、2×SSC及RQ1 DNase阳性处理。使用现用套装版本前核对组分及SDS。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。