低黏附三维肿瘤球：2000细胞/孔与半量换液

02实验原理

圆底低黏附表面把细胞集中，观察是否形成边界可辨、相对紧实的单个聚集体。先做500、2000、5000细胞/孔的密度预试，再固定后续条件。半量换液从侧壁取走50µL并补50µL，避免把球吸走；每次保留球是否仍在孔内的图像记录。

04材料与仪器

Corning4515低黏附板；HeLa健康单细胞液；EMEM、FBS、PBS；计数材料、P200移液器；37°C/5%CO₂培养箱；兼容微孔板150×g离心机；带标尺明场成像系统。

05配液与用量

每密度先3孔，外圈孔如加无菌PBS作蒸发缓冲应单独记录，不能把其算成检测孔。加药研究另行计算半换液后浓度，不因补入“原浓度药液”就假定处理始终恒定。

06时间安排

07开始前的准备

只使用状态好且团块少的起始细胞，先确认4515型号而非普通U底板；普通板不能靠“圆底”自动获得低黏附性质。预设每孔一团、无贴壁爬出、位置可重复成像作为形态目标；圆度≥0.8可作待验证教学阈值，不能用它证明细胞活性。

08逐步操作

1. 温和收获HeLa并计活浓度，记录起始活率，教学目标≥90%；团块明显时先优化解离，不把大团作为单细胞接种。
2. 按表配2mL、2×10⁴活细胞/mL悬液，轻柔混匀后每个候选孔加100µL，至少3技术孔。
3. 分装每排前重新轻混细胞管，保持同一体积和密度；板图标清密度、孔号和独立培养批次。
4. 盖好板，与相容配平板一起在室温150×g离心3分钟，将细胞集中到圆底；此条件为教学选择，先确认细胞与板的耐受。
5. 轻拿板放入37°C、5%CO₂培养箱，保持水平，不在移入时猛晃使集中团散开。
6. 6小时和24小时用明场拍完整孔底，记录是否一个中心聚集体、多个散团或细胞贴壁；采图时间保持简短。
7. 48小时和72小时在同放大倍数下拍照，测最大径与垂直短径，保持焦平面与标尺一致。
8. 第3天用枪头贴远离球体的一侧孔壁，从靠上液层缓慢吸50µL，肉眼或镜下确认球仍在孔底。
9. 沿侧壁缓慢补50µL37°C预温完全培养基，最终100µL，不直接向球体喷液；立即拍照确认未吸走或打散。
10. 第5天重复半量换液并观察，到第7天保存球体面积、圆度、长短径和有无坏死样中心；中心暗色不能单凭明场认定坏死。
11. 球近似圆形时可用平均直径d估算体积V=πd³/6；明显不规则团只报告投影面积和长短径，不强用球体积。
12. 每孔作为一个技术单位，先确定稳定成球窗口再进入处理实验；不同天记录同一孔，不把重复拍照当多个独立样本。

09结果判断与质控

例如球平均直径300µm=0.30mm，估计体积π×0.30³/6≈0.0141mm³；这只是几何近似。松散团、多团或贴壁爬出的孔应按预设形态标准标记，不能挑唯一好看的球代表全板。球直径变小可能是压实、丢细胞或死亡，需结合专门活性终点。

10实验记录模板

11常见问题与排错

多个小团：查初始团块、板型、集中步骤和移动震荡。第3天球消失：查吸液位置与吸出液，记录丢球，不能把空孔零面积当药效。边缘孔变化大：查蒸发与板温，固定外圈使用策略，不事后删除不利孔。

12参考资料

• Corning：4515官方产品页，已读取超低黏附表面、圆底、透明底及75–300µL工作体积。
• ATCC：HeLa CCL-2。接种数、150×g3分钟、换液日和形态阈值是教学候选，需本室验证。