01本篇适用条件
以纯化、已确认序列的1 kb无害平端教学DNA100 ng开始，去除原高保真聚合酶。指定3 kb pGEM-T载体及其2×Rapid Ligation Buffer、3 Weiss U/μL配套连接酶，BSL1 JM109受体。只做教学克隆，不构建致病、毒性或未知功能片段。
02实验原理
普通Taq可在平端产物3′端非模板依赖加A，配对T载体的3′T。原校对酶残留可能去除A尾，因此先纯化。单碱基突出端连接需要足够高效的感受态；蓝白筛选只是候选判据，插入方向随机，必须测序。
03安全与适用范围
样本仅为已知无害教学DNA或明确的非致病实验室株。戴实验服、手套，使用过滤枪头；配液、加模板和开扩增管用分开的器材与区域，扩增管只在产物区打开。凝胶和核酸染料按本地SDS处理；优先蓝光成像，断电后开电泳槽。扩增阳性不代表序列正确。 IPTG、X-Gal及抗生素按SDS配制和处置；使用无火源操作，不对未经确认的表达构建做诱导。
04材料与仪器
- 无害平端1 kb DNA20 ng/μL、GoTaq G2 5 U/μL及5×Colorless缓冲液、10 mM dATP、纯化装置。
- pGEM-T50 ng/μL、2×Rapid Ligation Buffer及配套连接酶3 Weiss U/μL、系统控制插入DNA。
- JM109高效感受态、SOC、LB/Amp/IPTG/X-Gal板、37°C培养设备、42°C水浴、PCR和测序材料。
05配液与用量
| 阶段 | 配方 | 核算 |
|---|---|---|
| 加A尾10 μL | DNA5 μL、5×液2 μL、10 mM dATP0.2 μL、Taq1 μL、水1.8 μL | DNA100 ng、dATP0.2 mM、Taq5 U、1×液 |
| DNA净化 | 加A后净化，20 μL Tris洗脱 | 重新定量，不假定全回收 |
| TA连接10 μL | 2×液5 μL、载体1 μL（50 ng）、插入50 ng、配套酶1 μL、水至10 μL | 1 kb插入:3 kb载体=3:1摩尔比；若插入25 ng/μL则2 μL、水1 μL |
| 背景对照10 μL | 插入改水，其余同TA连接 | 只有载体+连接酶 |
| 系统阳性10 μL | 2×液5 μL、载体1 μL、控制插入2 μL、酶1 μL、水1 μL | 依指定系统，不混用单位 |
| 选择板基液100 mL | LB琼脂冷至约50°C后加100 mg/mL Amp100 μL | 终100 μg/mL；每板表面涂100 mM IPTG100 μL及50 mg/mL X-Gal20 μL，吸收后用 |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| A尾与纯化 | 70°C30分钟 | 约1小时 |
| 连接 | 20–25°C | 1小时 |
| 转化/复苏 | 指定JM109 | 约2小时 |
| 平板/筛查 | 37°C | 16–24小时，后续测序 |
07开始前的准备
检查平端DNA仅一条1 kb带、无二聚体；配液前去除校对酶。2×Rapid连接液充分解冻混匀，取单次份，确认不是10×普通连接液。若净化后DNA浓度太低，需浓缩或成比例放大，不能让插入体积占满10 μL而挤掉缓冲液。
完整保留pGEM-T的3,000 bp环图、AmpR、lacZ、复制起点、T端和多克隆位点坐标。该图用于核对载体身份；插入1 kb后预计约4 kb，不能继续按空载体3 kb判读，也不能把该图用于pGEM-T Easy。
08逐步操作
- 核对平端DNA身份、1 kb长度及100 ng输入，保存输入胶和序列文件。
- 冰上按表配10 μL加A体系，最后加5 U普通Taq，轻吹混匀短离心。
- 70°C孵育30分钟，置冰；本步不是热灭活原高保真酶，也不用旧页37°C15分钟无缓冲体系。
TM042原Figure 3完整保留平端片段、1×含镁Taq液、0.2 mM dATP、5 U Taq、10 μL终体积、70°C 15–30分钟及取样连接七阶段。图用1 μL10×缓冲液；本篇用2 μL5×配套液，同为10 μL中的1×，孵育取30分钟。去除校对酶后再加A，不能把该图当作校对酶热灭活程序。
Promega，pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems，TM042修订10/21，Figure 3，物理PDF第15页（印刷14页）来源机构版权；公开技术资料完整图教学引用，未声明开放许可；不含商品推广查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗ - 净化加A产物至20 μL Tris，荧光定量并检查主要1 kb带，记录实际回收量。
- 按50×(1/3)×3=50 ng计算插入量，准备样本连接、无插入背景和系统阳性三管。
- 每管加入表中5 μL2×连接液、50 ng载体及配套酶1 μL，按各自插入/水补至10 μL。
- 20–25°C连接1小时；需最大转化数时可另用4°C过夜，记录所选路线，不自行热灭活含特殊组分体系。
- 为三种连接、无DNA细胞和完整质粒阳性分别编号，取对应匹配选择板，核对JM109身份与批次。
- 将2 μL连接液加入50 μL JM109高效化学感受态细胞，轻弹混匀，冰上20分钟；42°C水浴45–50秒，立即冰上2分钟，加950 μL室温SOC，37°C约150 rpm复苏90分钟。取100 μL各涂两张匹配选择平板，37°C倒置16–24小时；同批做无DNA细胞阴性及0.1 ng完整质粒转化阳性。此为指定JM109条件，不替换为其他感受态的通用热激参数。
- 记录各板白/蓝菌落数和背景；不因白斑立即判正确，挑6个独立白菌落并复制保存。
- 以载体两侧引物做菌落PCR，含空载体、已确认阳性和NTC，比较预计多出约1 kb的扩增带。
- 从2–3个PCR候选提取质粒，双向Sanger覆盖两接头和整段插入，核对方向、A/T接头及每个碱基。
TM042原Figure 1完整保留pGEM-T多克隆区的双链序列、克隆插入位置、T7/SP6方向及全部限制位点。它是指定3,000 bp pGEM-T的参考，不是pGEM-T Easy，也不是本次1 kb插入的实测序列；候选克隆仍须双向测序确认两接头和全插入。
Promega，pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems，TM042修订10/21，Figure 1，物理PDF第9页（印刷8页）来源机构版权；公开技术资料完整图教学引用，未声明开放许可；不含商品推广查看技术来源 ↗点击图片查看原图 ↗ - 仅将序列符合设计的克隆标为完成，保存株/板/质粒/序列的对应关系，按BSL1流程处理培养废物。
09结果判断与质控
系统阳性有可筛选克隆且无DNA阴性无菌，背景低于样本时方可解释样本。TA方向随机，白斑可含短插入或其他序列；正确克隆以全插入和两接头测序为准。高浓插入不保证提高正确率。
10实验记录模板
| DNA/加A批次 | 输入/回收ng | 插入:载体摩尔比 | 连接条件 | 转化批次/涂板比例 | 白/蓝/背景 | PCR/测序克隆 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 100/待测 | 3:1 | 室温1小时 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
样本无菌但系统阳性正常
检查A尾、校对酶残留、片段纯度与摩尔量，不直接加更多连接酶。
蓝斑偏多
查T端完整性和载体背景、选择板兼容性；颜色不代替测序。
白斑多但插入短
查引物二聚体或杂片段，重新纯化目标带。
12参考资料
- 用户提供网络手册物理第56–60、64–65页：读取TA、FAQ与加A尾多个体系，选含缓冲液、0.2 mM dATP、70°C30分钟路线，弃用无缓冲/体积不闭合方案及未经核实的单位换算。
- Promega，pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems Technical Manual TM042，修订10/21：实际全文核对5 μL2×液、50 ng载体、1 μL3 Weiss U/μL酶、室温1小时、摩尔比计算、JM109转化/蓝白筛查与最终鉴定。
- Promega，GoTaq G2 DNA Polymerase，修订03/18：核对普通Taq配套Mg²⁺缓冲体系及温度范围；加A体系采用TM042物理第15页图3的1×液、0.2 mM dATP、5 U Taq、10 μL、70°C15–30分钟范围，并以系统阳性和测序验证。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。