G418杀灭曲线与非病毒稳定细胞池筛选

02实验原理

G418消除未表达neo抗性的细胞。杀灭浓度依细胞与批次而变，必须用亲本细胞确定最低完全杀灭浓度；抗性存活后还要检测目标表达并检验撤药后的稳定性。

04材料与仪器

健康亲本NIH/3T3、已非病毒转染细胞、适用完全培养基、已知有效浓度50 mg/mL无菌G418储液、24孔板、6孔板、计数及荧光设备。

05配液与用量

每浓度3孔，每孔0.5 mL；10 mL可供多次换液但须分批新配、勿反复温育。储液浓度须使用标签的活性浓度；如批次仅给粉末质量而无活性，不自行折算。

06时间安排

07开始前的准备

24孔板为4行×6列，8个浓度各占连续3孔：0/50对应A1–A3/A4–A6，100/200对应B1–B3/B4–B6，400/600对应C1–C3/C4–C6，800/1000对应D1–D3/D4–D6。前一天每孔接种约2×10⁴活细胞，使开始加药时约20%–30%融合。设亲本无药、亲本加药和转染加药三组；稳定筛选时仍保留亲本加药对照。没有任何浓度完全杀灭时不宣称已选出剂量。

08逐步操作

1. 计数亲本活细胞，在24孔板每孔500 μL培养液中播种2×10⁴细胞，培养过夜。
2. 次日拍明场并确认20%–30%融合；记录每孔实际细胞状态和起始日期。
3. 按表逐浓度配10 mL培养液，轻混后标记0–1000 μg/mL，每浓度用新枪头。
4. 吸去旧液，每孔加入500 μL相应浓度培养液，3孔为一组，37°C、5%CO₂继续培养。
5. 每日观察活细胞形态并记录；每2–3天用相同浓度新药液全量更换，轻柔去除死亡细胞。
6. 第10及14天评估是否仍有能增殖的活细胞；必要时在独立同条件孔用活死计数确认，不把漂浮细胞简单等同全死。
7. 选使全部亲本重复孔在10–14天内无可增殖细胞的最低浓度；无药组应正常生长。
8. 把已恢复48–72小时的转染细胞及亲本分别计数，6孔板各2孔播种1×10⁵细胞/孔、2 mL培养液，另2孔亲本无药。
9. 贴壁后换成已确定浓度的药液，每2–3天换液；记录转染与亲本加药孔的死亡进程。
10. 持续筛选直至亲本加药孔全部死亡且转染孔形成持续扩增群体；必要时将过密幸存细胞分瓶，保持原药浓度。
11. 检测稳定池GFP阳性率及目标表达，至少记录5个视野；PCR仅作为身份辅助而不单独证明稳定整合。
12. 扩增已合格细胞池，分支一份继续原药、一份撤药，培养3–5次传代后再次比较表达、形态和生长。
13. 合格池标记为“多克隆稳定候选池”，冻存经污染检查合格的早代备份，建立来源、代次和筛选记录。

09结果判断与质控

必须同时满足亲本加药对照完全死亡、转染池能持续增殖、目标表达可检出且撤药观察稳定。没有单细胞起源追踪不得称克隆；有限稀释的低播种密度本身不证明单克隆。本篇不强制把维持浓度减半，维持浓度需另验证。

10实验记录模板

11常见问题与排错

所有组死亡：先查培养与药液配制，亲本无药死亡使本次杀灭曲线无效。亲本加药持续存活：延长观察并复核有效浓度，必要时新批次梯度重做。抗性池GFP阴性：检查载体结构与表达沉默，不能通过只留最亮视野修饰结果。

12参考资料

旧来源：网络手册物理73、209–210页；短版11–12页。现代核对：Addgene，Generating Stable Cell Lines，查阅2026-11-02；只采用最低完全杀灭浓度、每2–3天换药、与亲本死亡时间比较及表达复核原则。该网页其余病毒转导内容不纳入，本文明确从非病毒转染细胞开始。