01本篇适用条件
普通非感染性、已验证可用RNAiMAX转染的贴壁培养细胞；24孔板每孔最终500 μL、siRNA5 pmol即10 nM。使用预设计合成siRNA两条靶向同一普通教学报告基因或无害内源靶点；设非靶向、仅转染试剂、未处理及已知有效阳性。本文不提供病毒载体。
02实验原理
合成双链小RNA与脂质形成复合物进入细胞，RISC介导靶RNA降低。mRNA与蛋白时间窗不同；相同表型可能来自毒性或脱靶，需两条独立序列、匹配非靶向和表达定量共同解释。
原图保留双向转录、RNA转录物、异源融合、转化以及胞外合成导入路径。属于历史机制背景；本文只采用已合成短siRNA，不包含长dsRNA、病毒或表达载体制备。
原图完整保留Dicer、siRNA、RISC及靶mRNA路径。旧资料的部分术语与方向说明已简化；现代解释以向导链介导AGO/RISC识别靶RNA为准，合成短siRNA可直接进入相应途径，不能把图视作所有细胞的统一反应时间或效率。
03安全与适用范围
细胞操作在适配生物安全设施内进行；仅使用已确认无感染性的普通培养细胞和合成siRNA。RNAiMAX按SDS防护，细胞培养废液和含核酸耗材依本单位流程处理；本篇不含病毒递送。
04材料与仪器
- 无污染健康细胞、适配培养基、Opti-MEM、RNAiMAX、10 μM合成siRNA、非靶向和阳性siRNA、RT-qPCR及靶蛋白检测条件。
- 24孔板、细胞计数与显微镜、37°C5%CO₂培养箱、RNA/蛋白收样管；n至少3独立培养批次才用于推断。
05配液与用量
| 项目 | 本例配制/用量 | 核对点 |
|---|---|---|
| 10 μM siRNA工作液 | 20 μM储备液10 μL+水10 μL | 20 μL，1 μL=10 pmol |
| 每条件双孔脂质液 | RNAiMAX3 μL+Opti-MEM47 μL | 50 μL；每孔1.5 μL RNAiMAX |
| 每条件双孔siRNA液 | 10 μM siRNA1 μL+Opti-MEM49 μL | 50 μL、10 pmol |
| 混合/每孔 | 两管各50 μL混合100 μL；每孔取50 μL加450 μL培养基 | 最终500 μL，siRNA5 pmol即10 nM |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 预计时间 |
|---|---|---|
| 铺板 | 24孔、每孔0.5–2×10⁵细胞范围内确定 | 前1天 |
| 形成复合物 | 室温 | 5分钟 |
| mRNA检测 | 37°C | 24–48小时 |
| 蛋白检测 | 37°C | 48–72小时，按半衰期验证 |
07开始前的准备
选定每孔1×10⁵细胞，前一天铺板使转染时60%–80%汇合。6条件（siA、siB、非靶向、脂质、水/未处理、已知阳性）各为不同收样时间预留独立孔；本次每条件双孔是技术/培养重复，不冒称独立生物学重复。本例精确补足两管各50 μL；需操作余量时全套同比放大，不改变每孔剂量。
保留细胞播种、脂质体和siRNA分管稀释、等体积复合、孵育、加细胞与观察全部七阶段及三种孔板列。本文24孔剂量若做梯度，应以正文计算替换对应siRNA用量；不把图中的固定10 nM当作所有细胞的最优浓度。
08逐步操作
- 记录细胞来源、传代数、支原体结果，计数后每孔铺1×10⁵细胞，37°C5%CO₂培养过夜。
- 转染当天在同样倍率拍各孔，确认健康且60%–80%汇合；过密或大量脱落先重铺。
- 按板图为每条件及收样时点编号，预留非靶向、仅脂质、未处理和已知有效siRNA对照。
- 各孔换为450 μL新鲜适配完全培养基；本例不加抗生素，记录血清比例保持所有孔一致。
- 各条件脂质管加47 μL Opti-MEM和3 μL RNAiMAX，轻混至50 μL。
- 各siRNA管加49 μL Opti-MEM和1 μL10 μM对应siRNA，混匀；脂质对照加50 μL Opti-MEM无siRNA。
- 将50 μL siRNA稀释液加入50 μL脂质稀释液，轻混，室温5分钟形成复合物。
- 每孔滴加50 μL相应复合物，前后左右轻摇分布；未处理孔加50 μL Opti-MEM，使各孔最终500 μL。
- 37°C5%CO₂培养，记录6–24小时形态和细胞数量变化，不因未见表型就追加siRNA。
- 24–48小时从预定mRNA孔收RNA，记录每孔细胞状态；做DNase处理、RT和no-RT/NTC。
- 用经验证效率相近的引物检测靶mRNA及稳定参考基因；保留原始Cq，不仅保留软件百分比。
- 计算ΔCq=Cq靶−Cq参考；ΔΔCq=siRNA−非靶向；在扩增效率接近2时剩余表达=2^(−ΔΔCq)，敲低率=(1−剩余)×100%。
- 48–72小时从独立蛋白孔取样，以目标蛋白和合适归一指标验证；不能把mRNA变化等同蛋白清除。
- 比较siA/siB、非靶向和脂质组的表达及存活；只有两条独立序列方向一致且不被毒性解释时才建立候选效应。
- 在至少3次独立细胞培养批次重复确定条件，报告每次效应和变异；功能机制需要救援等额外证据。
- 保存板图、原图、Cq/蛋白图及剂量时间窗；剩余RNAiMAX4°C不冷冻，siRNA按标定分装条件保存。
09结果判断与质控
阳性siRNA应降低其已知靶点，非靶向/脂质/未处理组用来识别非特异反应。教学起点可预设mRNA降低≥70%且存活≥80%作为筛查线，属于本地标准，不是所有细胞通用要求；报告真实结果，未达线不掩盖。
原Figure 2保留未转染、化学合成、体外转录三幅显微图和全部定量柱图、坐标及标签。原例为HeLa、β-actin与75 nM；此为比较两种制备路线的历史数据，不是本文低剂量筛选的推荐终浓度，也不证明所有基因都可达到原图抑制率。
原Figure 3保留Ku70信号与DAPI两列、混合siRNA与未转染两行。原例采用RNase III产生的混合siRNA和100 nM；本文采用合成siRNA及非靶向对照，不能把未转染对照当作非靶向对照，也不沿用该剂量。
原Figure 4保留两种载体处理以及GFP、DAPI四幅图和列行标签。它是载体表达的长期沉默历史示例，本文合成siRNA属于短期转染；不能由本图推出本文可获得稳定沉默。
原Figure 5完整保留NT、SEC、Mo-U6、Hu-U6、Hu-H1五个柱及全部显微panel和标签。原例比较RNA表达盒，不是本文合成siRNA；不同启动子结果用于理解验证必要性，不直接作为本篇预期效率。
10实验记录模板
| 细胞/传代/汇合度 | siRNA身份/批次 | pmol/孔/最终nM | RNAiMAXμL/孔 | 时点/形态/存活 | 原始Cq/归一 | 蛋白变化 | 独立批次/结论 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。
11常见问题与排错
敲低差
先看已知阳性和转染状态，再查siRNA序列及靶mRNA表达；在5–20 nM范围小规模优化。
两条结果相反
查脱靶、不同转录本和毒性，不只挑有效的一条。
mRNA降而蛋白不变
按蛋白半衰期延长时间，但维持细胞健康并使用独立孔。
12参考资料
- 旧网络手册物理第152–161页：RNAi原理/方法，未采用旧网页序列、病毒载体或“无需检查脱靶”经验。
- Thermo Fisher Scientific，Lipofectamine RNAiMAX Reagent Protocol，2013 Rev.1.0，物理第1–2页，查阅2026-11-02（Asia/Taipei）：已核60%–80%汇合、24孔每孔5 pmol/1.5 μL、室温5分钟、37°C1–3天。本文精确补足体积并补充两条siRNA和表达/毒性验证。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。