01本篇适用条件
一块1 mm厚迷你SDS-PAGE凝胶，含普通无害蛋白标准及低量教学蛋白；各浴液50 mL完全覆盖凝胶。固定使用Chevallet等的Short silver nitrate staining（Protocol A），不拼接旧手册Blum/EMBL/Vorum三配方。不能把银染视为通用定量法或保证质谱兼容。
02实验原理
先固定去除干扰物，以硫代硫酸盐致敏，再硝酸银浸染，碱性显影液将局部银离子还原为金属银。显影具有快速放大与蛋白依赖性，终点由条带和背景共同判断，不能仅照固定分钟无限显色。
03安全与适用范围
甲醛有害，在通风橱内由受训指导者配显影液；乙醇易燃、冰醋酸腐蚀，佩戴护目镜、实验服和合适手套。硝酸银及接触银的全部浴液单独收集含重金属废液。本文不使用银氨体系，不存放或干燥银氨残留物。
04材料与仪器
已跑蛋白胶、无粉手套、新洁净染色盘至少5只、超纯水、乙醇、冰醋酸、20%w/v硝酸银储液、10%w/v五水硫代硫酸钠新鲜储液、碳酸钾、37%或40%甲醛原液（记录实际标签）、Tris碱、低速摇床、秒表、成像设备。
05配液与用量
| 每份50 mL浴液 | 配法 | 终浓度/说明 |
|---|---|---|
| 固定液 | 乙醇15 mL+冰醋酸5 mL，水补至50 mL | 30%乙醇/10%乙酸v/v |
| 乙醇洗液 | 乙醇10 mL，水补至50 mL | 20%v/v；配2份 |
| 致敏液 | 10%五水硫代硫酸钠100 μL，水至50 mL | 0.02%w/v，约0.806 mM |
| 硝酸银液 | 20%w/v硝酸银储液509.6 μL，水至50 mL | 12 mM；AgNO₃摩尔质量169.87 |
| 显影液 | 碳酸钾1.50 g；10%五水硫代硫酸钠6.25 μL；甲醛原液12.5 μL；水至50 mL | 3%碳酸钾；甲醛原液0.025%v/v，非纯甲醛0.025% |
| 终止液 | Tris碱2.0 g+冰醋酸1.0 mL，水至50 mL | 4%Tris/2%乙酸 |
| 清水洗液 | 每次50 mL | 多次更换，总约500 mL |
6.25 μL须用合适移液器；也可把10%硫代硫酸钠10倍稀释成1%，显影每50 mL加62.5 μL并相应减少水。显影液当天配，甲醛最早在使用前1小时加入。
06时间安排
| 阶段 | 浴液/时间 | 条件 |
|---|---|---|
| 固定 | 至少30分钟 | 室温轻摇 |
| 洗涤 | 20%乙醇2×10分钟；水2×10分钟 | 每次新液 |
| 致敏/冲洗 | 1分钟；水2×1分钟 | 严格秒表 |
| 银浸染 | 20分钟 | 12 mM硝酸银 |
| 冲洗/显影 | 水10秒；显影约1–5分钟起观察 | 每胶独立新显影盘，以背景前终止 |
| 终止/清洗 | 终止30分钟；水2×30分钟 | 室温 |
07开始前的准备
先排列固定、洗水、致敏、两只水盘、银液、显影和终止盘，显影前必须已备好终止液。所有器具与水洁净，胶不接触裸手。20–25°C进行，环境超过30°C背景可能上升。高两性电解质的二维胶需更长固定去除干扰，本篇短程优先迷你一维胶。
08逐步操作
- 检查凝胶完整及标准上样范围，拍未染胶定位图，记录胶厚、样本与方向。
- 在通风处按表配固定、致敏、硝酸银、显影和终止液，确认使用碳酸钾而非碳酸氢盐。
- 将胶完全浸入50 mL固定液，室温轻摇至少30分钟，避免胶折叠。
- 移入50 mL20%乙醇洗10分钟，换第二份20%乙醇再洗10分钟。
- 换50 mL水洗10分钟，再换新水洗10分钟；所有浴液完全覆盖胶。
- 将胶移入0.02%五水硫代硫酸钠致敏液，轻摇1分钟，用秒表计时。
- 立即依次转入两份新水各洗1分钟，不延长暴露等待别的胶。
- 转入12 mM硝酸银液浸染20分钟，记录起止；轻微变黄不等同失败。
- 将胶移入新水仅漂10秒，随即转到新鲜显影液盘，开始计时并持续轻摇。
- 观察条带显现及背景，常1–5分钟开始可见；达到足够对比立即转终止液，记录实际显影秒数。
- 终止液轻摇30分钟，使反应充分停止；按化学废物类别收集银液与显影液。
- 水洗2次，每次30分钟，拍摄未经裁剪全胶原图，保持曝光避免强条带饱和。
- 记录各条带及背景、所有换液与终点，短期存清水中；需质谱则先由接收平台确认体系并尽可能当日处理。
09结果判断与质控
标准和教学蛋白应形成可区分条带，背景足够低。响应依蛋白种类和显影而非简单线性；不得用银染灰度直接报告绝对蛋白质量。本含甲醛显影体系与质谱仅有限兼容，不能照抄旧文“三种方法均兼容质谱”。
Figure 2完整保留A快速硝酸银、B长程序硝酸银、C无醛银氨、D甲醛固定银氨全部四panel。原例9 μg大肠杆菌总蛋白，pH4–8第一向/10%第二向；不能用不同处理后斑点深浅直接作相对定量，也不表示四体系都兼容质谱。
10实验记录模板
| 胶号/厚度/蛋白量 | 各液配制/盐型 | 温度 | 固定/致敏/银染起止 | 显影秒数/终点 | 空白区背景 | 原胶图 | 废液/质谱条件确认 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
全胶背景深：查水、器具、硫代硫酸盐新鲜度与显影时间。无条带：查银液浓度、碳酸盐是否错用碳酸氢盐、上样量。表面银镜：查玻璃/胶面污染及手印，不强刷胶面。
完整保留SDS结合不足、过载双panel和银染杂点的原胶图。它们来自二维电泳排错背景，不全部是同一种染色体系；仅用于比较可见异常，不能由外观确定唯一原因。凝胶浓度、负载、SDS和染色条件以本篇核实的流程为准。
Figure 1完整保留A/B及所有箭头。A为HeLa 80 μg蛋白的快速硝酸银染色，B为分泌蛋白150 μg的银氨染色；均为pH4–8第一向/10%第二向。原图展示不同染色体系伪影，本文只采用硝酸银路线，不把银氨条件混入。
12参考资料
旧来源：短版物理37–39页。现代技术核对：CNRS/CEA/Université Joseph Fourier，Chevallet M等，Silver staining of proteins in polyacrylamide gels，Nature Protocols 2006，1:1852–1858，DOI 10.1038/nprot.2006.288，开放全文PMC1971133，查阅2026-11-02。完整采用Protocol A及配套碳酸钾显影/Tris终止，不采旧表AgO₃错字、不混用三套配方、不保证质谱兼容；50 mL为迷你胶缩放。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。