夹心ELISA：RayBio人IL-6预包被板完整示例

02实验原理

捕获抗体、biotin检测抗体及HRP-streptavidin形成夹心，TMB反应经酸终止后450 nm读取。每板必须重新做标准曲线；低于检出能力不是零表达，超过最高标准需稀释重测。

04材料与仪器

• ELH-IL6-1及配套20×Wash、5×Diluent B、检测抗体、600×HRP、TMB和Stop。
• A/B普通人细胞培养上清、相同未条件化培养基、纯水、低吸附标准管。
• 4条8孔板条、封板膜、多道移液器、低速微孔板振荡器、450 nm酶标仪、计时器。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

试剂及样本平衡至18–25°C；冻融上清1000×g离心10分钟去碎屑，取清液并记录条件。画28孔板图，空余4孔不参与实验。各阶段28孔需2.8 mL试剂，预留损耗；3轮四次洗共需100.8 mL洗液，200 mL准备量覆盖储液槽损耗。检查洗液结晶溶清，HRP轻吹混匀，标准和抗体开瓶前短暂离心收液。

08逐步操作

1. 依表配1×Diluent B和Wash，标明稀释倍数；不要用1×Diluent A替代培养上清路线的B。
2. 标准瓶按本版加500 μL 1×B，温和混匀至完全溶解得12000 pg/mL；现批标示不符时先核对，不能直接照抄500 μL。
3. 配S1：40 μL标准储备加440 μL B。给S2–S7各加400 μL B，逐级转移200 μL，每次混匀后换头再下传；零点只加B。
4. 按表为A/B各配1:2和1:4；再配培养基空白及100 pg/mL加标QC。全部充分混匀，记录每一步总体积和倍数。
5. 按板图每孔加100 μL标准、稀释样本或QC，均双孔。覆盖，18–25°C轻摇2.5小时，记录本机振荡参数，避免飞溅或气泡。
6. 弃液，每孔加300 μL 1×Wash，充分吸尽或倒尽，连续4次。最后倒置轻拍洁净吸水纸，不让孔长时间干燥。
7. 检测抗体瓶加100 μL 1×B复溶；取40 μL复溶抗体加3160 μL B，精确80倍。不要把几乎看不到的冻干组分当作空瓶丢弃。
8. 每孔加100 μL检测抗体工作液，覆盖，室温轻摇1小时；然后按第6步再洗4次，每次300 μL。
9. 临用轻混HRP原液，取5 μL加2995 μL B配600倍工作液；各孔加100 μL，覆盖，室温轻摇45分钟，稀释后不留次日使用。
10. 按第6步再洗4次，保证各孔无残液且无堵塞。换干净储液槽，避免抗体或HRP带入TMB瓶。
11. 每孔加100 μL即用TMB，按相同顺序加液，室温避光轻摇30分钟；高标准应逐渐变蓝，不能根据某个样本颜色提前单孔终止。
12. 按同一顺序每孔加50 μL Stop，颜色由蓝转黄，轻混后立即450 nm读板；记录实际加液及读取时间，气泡先处理。
13. 保存所有原始OD，取双孔平均并扣零点背景；按手册/本机构验证的曲线模型拟合本板标准，不套厂家示意曲线，不强迫原点。
14. 由曲线求每个稀释样本浓度，分别乘2或4还原原上清值，检查两稀释结果相近及QC回收。加标回收=(加标QC−未加标QC)/100×100%。
15. 教学预设样本双孔CV≤15%、QC回收80%–120%作为初查，接近空白时不靠CV硬判。最低标准1.37 pg/mL低于标称3 pg/mL检出能力，不据此声称可靠定量；高于1000 pg/mL应稀释重测，低信号报告低于适用检出/定量范围。

09结果判断与质控

标准随浓度有序变化、双孔一致、培养基及加标QC合理，且样本稀释后回算相近，才支持结果。培养上清浓度还受细胞数、收集时间和体积影响，跨组比较应记录并按研究目的归一化。不同稀释结果偏离提示基质效应，不能只选符合预期的一次。

10实验记录模板

11常见问题与排错

零点或全板背景高

检查洗板彻底性、HRP稀释和TMB污染；先解决背景，不用大幅扣减制造标准曲线。

标准正常但样本稀释不平行

查基质抑制/增强及样本处理，验证适合稀释度，不外推。

双孔差大

查加液顺序、气泡、漏加、板边蒸发和洗头堵塞，记录后重做。

12参考资料

• RayBio Human IL-6 ELH-IL6官方手册，2025-09-17：已核对500 μL复溶、三倍标准梯度、检测抗体80倍、HRP600倍、4×300 μL洗板及所有孵育/读板条件。本文精确配制5+2995 μL实现600倍，避免把原文近似举例视作精确终体积。