逆转录合成 cDNA：High-Capacity 20 μL 体系逐管配制

02实验原理

逆转录酶以 RNA 为模板合成 cDNA。随机引物、oligo(dT) 和基因特异引物各有覆盖范围与偏差，选择取决于目标和试剂体系。样本间输入量与反应处理应尽量保持一致。

04材料与仪器

• 上述含RNase inhibitor的High-Capacity套装，原装buffer、dNTP、random primers和MultiScribe酶；不与另一TaqMan RT试剂盒拼接。
• A、B各至少1.25 μg已质控RNA，浓度≥50 ng/μL；用于A-RT、A-NoRT、B-RT、B-NoRT。
• 无核酸酶水、4支PCR管、2支混液管、4支cDNA稀释管，过滤枪头、冰盒、可运行120分钟温育的PCR仪。
• 后续已验证的qPCR引物和独立NTC，用于检查RT产物及残余DNA。

05配液与用量

A/B两份RT共享液配3份：buffer6 μL、dNTP2.4 μL、random primers6 μL、酶3 μL、RNase inhibitor3 μL、水9.6 μL，共30 μL，每管分10 μL。另配3份No-RT混液：同上但酶0、水12.6 μL，共30 μL。各剩10 μL为损耗余量，不混用两个共享液。

06时间安排

07开始前的准备

使用RNA提取最终清理后的浓度计算，而不是最初粗提浓度。A、B分别用RNA体积=500/浓度（ng/μL）计算，再补水到10 μL；例如100 ng/μL RNA取5 μL加水5 μL。若低于50 ng/μL，500 ng无法塞入10 μL，停止并统一降低全部样本输入量或重新浓缩，不能超过20 μL总反应。RNA应有完整性、纯度和去DNA记录。套装各组分冰上解冻，轻混并短暂收液，核对版本确实包含RNase inhibitor。 若提取后去DNA清理仅回收到低浓度RNA，应先根据实测浓度重新做输入预算；不要为了达到500 ng而加入含盐粗提液或省略去DNA清理。A与B的RNA工作液分别配制、使用独立枪头，配液时不打开任何既往PCR产物。操作前在记录表写好四管的RNA体积、水体积、酶是否加入，并由第二人或独立重新计算复核；没有复核条件时逐项读回标签和计算式。No-RT用于识别残余DNA，不能代替RNA完整性检查，也不能证明两个样本逆转录效率相同。

08逐步操作

1. 标记A-RT、A-NoRT、B-RT、B-NoRT及对应稀释管，画反应图；记录每份RNA来源、清理后浓度和本次输入500 ng。RNA保持冰上，避免长时间敞盖。
2. 分别准备A、B的50 ng/μL RNA工作液，至少各25 μL。例如100 ng/μL原液各取12.5 μL加12.5 μL水，轻吹打5次。两个反应各需10 μL，额外5 μL作损耗；不要在每管凭近似液面调整RNA量。
3. 先配No-RT共享液：水12.6 μL、10×buffer6 μL、25×dNTP2.4 μL、10×random primers6 μL、RNase inhibitor3 μL，总30 μL。轻吹打约8次，冰上待用；此管不得接触MultiScribe。
4. 再配RT共享液：水9.6 μL、10×buffer6 μL、dNTP2.4 μL、random primers6 μL、RNase inhibitor3 μL，最后加MultiScribe3 μL，总30 μL。轻混不剧烈涡旋，短暂收液后冰上放置。
5. 向A-NoRT、B-NoRT各分装No-RT共享液10 μL，分别加入对应RNA工作液10 μL。每管轻吹打2次、盖紧，独立放置，防止后面酶液溅入。

   

6. 向A-RT、B-RT各加RT共享液10 μL，再加对应RNA工作液10 μL；每管换头，轻吹打2次。确认每管总20 μL、无明显气泡；所有管盖紧后短暂离心3–5秒。
7. PCR仪设20 μL，按本机兼容方式启用热盖，输入25°C10分钟、37°C120分钟、85°C5分钟、4°C保持。No-RT和RT同机同程序处理；不要把其他厂商的42°C30分钟套入此体系。
8. 放管、核对管位后启动，保存程序和开始时间。37°C阶段必须完成120分钟；若中途停电或程序提前结束，标记批次异常，不把它记成完整反应。
9. 终止完成后取管放冰上，短暂收液。分别向4支预标稀释管加80 μL水，再把相应20 μL反应液全部加入并轻吹打8次，总100 μL，为1:5稀释。
10. 在管上写“原RNA500 ng/反应、RT总体积20 μL、稀释后100 μL、日期、RT/No-RT”。稀释后每μL对应5 ng起始RNA，而不是声称有5 ng/μL纯cDNA；qPCR加2 μL即10 ng RNA等效量。
11. 将每份分成20–25 μL小份。当天/24小时内使用放2–6°C，较长保存−15至−25°C，建议常用−20°C；记录盒位，避免反复冻融。不要用−20°C替代PCR仪4°C阶段的程序设定。
12. 用同一已验证qPCR引物分别检查RT、匹配No-RT和NTC，比较扩增及熔解曲线。No-RT出现目标特异信号时暂停表达比较，先评估gDNA及污染；没有RT信号时同时检查RNA完整性和独立阳性cDNA。

09结果判断与质控

合格产物的定义是后续有效qPCR中RT有预期特异信号、No-RT及NTC无相同特异扩增，且RNA输入及稀释过程可追溯。不能把无色液体或吸光度读数当作逆转录成功证据。样本间用相同原始RNA输入和相同稀释倍数比较；残余RNA和游离核苷酸使反应混合物吸光度不能代表纯cDNA浓度。

10实验记录模板

11常见问题与排错

所有RT都没有扩增

检查是否漏加酶、温育是否跑满、RNA是否降解及qPCR阳性对照；不要直接重复加酶而忽略整条流程。

No-RT也有目标信号

若NTC干净，优先查样本gDNA并核实引物是否跨外显子；重新去DNA后重做RT。若NTC同样阳性，查配液或扩增产物污染。

某样本RNA太稀

统一降低所有比较样本输入并验证，或重新提取；不能让某样本RNA超过10 μL而挤占规定混液。

重复差异很大

核对混匀、工作液计算、冻融及RT批次；同一批设置共同参考RNA，保留异常记录而非挑选结果。

12参考资料

• High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol，cms_042557：已核对含RNase inhibitor的20 μL配方（7页）、25°C10分钟/37°C120分钟/85°C5分钟（8页）及cDNA储存（9页）。
• No-RT以水替代1 μL逆转录酶，500 ng输入和1:5稀释为本教程设计；并非手册承诺所有基因均具有相同逆转录效率。