RT-qPCR 相对定量：Power SYBR 20 μL 体系与 ΔΔCq 算例

02实验原理

实时荧光定量 PCR 在扩增过程中测量荧光并估计 Cq。相对定量先将目标与稳定内参归一化，再与校准组比较。2⁻ΔΔCq 假设扩增效率接近理想且目标与内参相当；不满足时需使用适当的效率校正方法。

04材料与仪器

• Power SYBR Green PCR Master Mix 2×，A/B的cDNA和匹配No-RT，独立无核酸酶水。
• 小鼠Actb及Rplp0两对引物，各有序列、来源、扩增长度、单一熔解峰及效率报告，工作液各10 μM；缺任何一项先验证。
• ABI7500兼容的96孔光学反应板和光学膜、板离心适配器、过滤枪头及合格移液器、避光盒。
• 仪器维护/染料校准记录、板图、可导出Cq与扩增曲线的数据软件。

05配液与用量

每个基因安排A、B、A-NoRT、B-NoRT、NTC各3复孔，共15孔。各基因单独配17份共享液：2×mix170 μL、Forward10.2 μL、Reverse10.2 μL、水115.6 μL，总306 μL；每孔分18 μL，另加模板/对照2 μL。两个基因分别配液，共30孔，不把两种基因的引物放同一混液。

06时间安排

07开始前的准备

首次做该引物对时先用混合cDNA做5点四倍稀释：D0为原1:5稀释cDNA，D1取D0 20 μL加水60 μL，混匀；依次同法配D2–D4，各点三复孔及NTC。两引物对用本20 μL体系分别验证，绘Cq对log10输入量回归，效率E=10^(−1/斜率)−1；教学预设90%–110%、R²≥0.99且特异峰单一。目标/内参效率应相近，未达到时先优化或使用适当效率校正方法。稀释点超出检出范围不硬纳入回归。另用独立生物学样本验证候选内参稳定；没有证据不直接报告ΔΔCq。

08逐步操作

1. 建板图：Actb用A1–A3放A，A4–A6放B，A7–A9放A-NoRT，A10–A12放B-NoRT，B1–B3放NTC；Rplp0相同顺序放C1–C12及D1–D3。每份连续3孔，写明孔号后再开试剂。
2. 冰上解冻cDNA、引物和需要解冻的试剂，2×mix按瓶签温度要求处理，轻混后短暂收液，避光。核实仍为Power SYBR普通标准体系，不因名称接近就换成PowerUp/Fast程序。
3. Actb共享液按170 μL 2×mix、10.2 μL Forward、10.2 μL Reverse、115.6 μL水配至306 μL，缓慢吹打约10次并短暂收液。Rplp0另管按相同体积配制，只换对应成对引物。
4. 向板图对应孔分别分18 μL相应共享液；每加完一行立即勾选。避免将Actb共享液分到Rplp0孔，剩余液体不倒回原瓶。
5. 先给全部NTC孔加2 μL水，接着给No-RT孔各加2 μL相应No-RT，最后给A/B孔各加2 μL对应cDNA。所有加样换过滤头，同一孔不重复加；总量核对20 μL。
6. 用适用光学膜封板，专用压膜工具沿每孔及四周压实，勿用手触光学孔顶。板离心约500×g、1分钟（须在板及转子许可范围内），检查无气泡和挂壁，膜边无翘起；失效封膜需换新。
7. 在ABI7500选择SYBR Green、与此Power SYBR体系兼容的被动参比设置和Standard运行模式，填20 μL反应体积，输入样本与技术复孔。板型、参比设置和程序保存到原始运行文件。
8. 设置95°C10分钟激活；40循环95°C15秒、60°C1分钟，在60°C步骤采集荧光。激活步骤不可缩成其他快速试剂的20–30秒；本体系不自行加入额外UNG。
9. 加上7500标准熔解分析：95°C15秒、60°C1分钟，再按本机软件标准dissociation ramp逐步升到95°C并采集荧光。记录软件给出的实际升温速率；硬件/软件不支持此程序时先由仪器负责人建立等价已验证程序，勿随意套用CFX的步进参数。
10. 确认板方向和装载位置后上机，启动并保存运行文件。结束后不要在前扩增区开板；已扩增板保持密封进入后扩增废物路线。
11. 先看所有扩增曲线、基线和阈值是否在指数扩增区，再看熔解峰。NTC或No-RT若出现与样本相同熔解峰，暂停该基因结果解释；晚期低温峰可能为二聚体，但需产物验证，不能只凭Cq晚就当作阴性。

    

    

    

12. 对每组三孔检查Cq离散。教学预设技术复孔最大差≤0.5 Cq；超过时核查漏加样、气泡、低拷贝和曲线，标记原因并按事前规则重做。不得仅删掉最不符合预期的孔，也不把未扩增孔赋值为40参与平均。
13. 在对照、特异性和效率都合格后，分别求同一样本目标与内参的技术复孔平均Cq，再算ΔCq=Cq目标−Cq内参。用A为校准，ΔΔCq=ΔCq(B)−ΔCq(A)，相对表达=2^(−ΔΔCq)。
14. 演示数值：A目标均值25、内参20，因此ΔCq(A)=5；B目标23、内参20，因此ΔCq(B)=3；ΔΔCq=3−5=−2，相对表达=2²=4。A定义为1，B为A的4倍。这是算术示例，不是本次实测数据。
15. 正式比较对每个独立生物学样本分别计算ΔCq，再在相应统计尺度上汇总及估计不确定性；技术三复孔不算n=3。保留原始Cq表、曲线、排除原因、效率报告、板图及分析公式，禁止只导出最终倍数。

09结果判断与质控

成功要求包含可靠的NTC/No-RT、特异熔解峰、技术复孔一致、目标和内参效率适用且内参稳定。2⁻ΔΔCq只有在相关效率假设成立时才用于简化计算，不能把一个漂亮倍数当作质量保证。无扩增是“未检出/需进一步判断”，不是绝对零表达；两组只有一份生物学样本时不声称存在有统计学证据的组间差异。

10实验记录模板

11常见问题与排错

NTC晚期扩增

比较熔解温度与样本，结合电泳区分二聚体和污染；同峰时停止结果解释并换工作液复查。

No-RT阳性但NTC干净

重点查RNA残余gDNA及引物特异性，重新去DNA；不能靠在分析软件中取消No-RT孔解决问题。

技术复孔差异大

检查移液和封膜，低拷贝样本需重新设计输入和重复策略，不能任意提高Cq截止值。

目标和内参效率不同

先优化引物/模板输入及抑制物；必要时采用效率校正模型，不继续套2⁻ΔΔCq。

12参考资料

• Power SYBR Green PCR Master Mix User Guide，4367218 Rev.E：已核对2×组分、10–50 μL适用体积、300 nM引物矩阵及95°C10分钟/40循环95°C15秒、60°C1分钟。本例20 μL为按比例缩小的明确教学规模，熔解采用7500软件标准程序。
• MIQE guidelines，PMID19246619：作为报告与质量原则参考；0.5 Cq、效率范围及R²为本文预设教学验收条件，不冒充所有实验通用强制阈值。