01本篇适用条件
本教学用纯化BSA和经本地验证的兔抗BSA（Sigma B1520）/抗兔HRP（CST #7074）抗体对，点到0.45 μm硝酸纤维素膜。起始稀释一抗1:1000、二抗1:5000；实际批次须已有BSA点样验证记录。此处靶标为BSA，因此封闭和抗体稀释不得使用BSA或含牛血清白蛋白的奶粉，采用0.5%鱼皮明胶。Dot blot不经电泳，不能提供分子量、聚集状态或某个样本中抗体特异性的完整证据。
02实验原理
同体积、不同质量的BSA点样建立可见信号序列。主膜与无一抗对照同样点样，只在一抗步骤不同，能识别二抗及膜背景；一块PBS空白不能替代无一抗对照。
03安全与适用范围
戴手套和护目镜，仅夹膜边。HRP显色物、抗体和NC膜按SDS处置；本例不含甲醇活化，不使用明火，NC干膜易燃。
04材料与仪器
- BSA1 mg/mL储备液、1×PBS、0.45 μm NC膜两片各约3×4 cm。
- 已在BSA点样中验证的兔抗BSA及抗兔HRP，记录货号和批次；Pierce ECL #32106。
- Tris、NaCl、Tween-20、10%鱼皮明胶储备液、膜盒、摇床和化学发光成像仪。
05配液与用量
| 液体 | 配制 | 目的 |
|---|---|---|
| BSA工作液100 μg/mL | 1 mg/mL BSA10 μL+PBS90 μL | 再取50 μL+PBS50 μL得50 μg/mL，依次得25/12.5 μg/mL |
| 每点2 μL | 上述100、50、25、12.5 μg/mL | 200、100、50、25 ng；PBS点为0 |
| TBST1 L | 1 M Tris pH7.5 20 mL、5 M NaCl30 mL、Tween-20 1 mL、水949 mL | 20 mM/150 mM/0.1% |
| 封闭/稀释液30 mL | 10%鱼皮明胶1.5 mL+TBST28.5 mL | 0.5%w/v；两膜约需22 mL，另留配抗体与操作余量，不含BSA或奶粉 |
| 一抗/二抗各3 mL | 一抗3 μL+稀释液2997 μL；二抗0.6 μL不直接量取 | 二抗先10 μL原液+90 μL稀释液，取6 μL+2994 μL，最终1:5000 |
| ECL3 mL | A1.5 mL+B1.5 mL | 1:1，覆盖两膜总24 cm²有余量 |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| 点样固定 | 室温平放 | 自然干燥30分钟 |
| 封闭 | 室温轻摇 | 1小时 |
| 一抗 | 4°C轻摇 | 12–16小时 |
| 洗膜/二抗/洗膜 | 室温 | 3×5分钟/1小时/3×5分钟 |
| ECL | 均匀覆盖 | 1分钟 |
07开始前的准备
本例每块膜点5个浓度含空白、各双点，共10点，点间距至少8 mm。准备两片相同布局，一片主膜、一片无一抗；将网格画在膜背面，用铅笔标边角。抗体若未经过本地BSA验证，应先小规模验证，不将本例稀释倍数当作所有抗体通用。
08逐步操作
- 标记两片膜及点位图，确认膜没有折痕和污染。用镊子夹边，平铺在洁净不吸液薄膜上。
- 按表依次配四级BSA工作液，每一级充分混匀再取下一级；另备PBS作为零点。
- 每个点位缓慢加2 μL对应液体，枪头悬于膜面，不戳膜；同一水平和时间完成两膜双点，点扩散即暂停检查体积与膜状态。
- 室温防尘平放30分钟至点样区域自然干燥，不吹热风，不用纸直接压蛋白点。
- 两片膜分别用PBS约5 mL润湿2分钟，再各加5 mL 0.5%鱼皮明胶/TBST，室温轻摇封闭1小时。
- 主膜加3 mL 1:1000兔抗BSA液，4°C轻摇12–16小时；对照膜加3 mL同稀释液而无一抗，其余条件相同。
- 分别弃液，每片膜各用5 mL TBST洗5分钟，换新液重复3次，膜全程浸没且不互相重叠。
- 二抗先用原液10 μL+稀释液90 μL配1:10中间液，取6 μL中间液加2994 μL 0.5%鱼皮明胶/TBST配3 mL最终1:5000液；两片膜需各3 mL，按两份配足。
- 两膜均加最终二抗，室温轻摇1小时。避免叠氮钠，因为它可抑制HRP活性。
- 各膜再以新鲜TBST5 mL洗5分钟，共3次；将膜有效面朝上并排，沥去多余洗液，不让蛋白点干燥。
- 混ECL A1.5 mL+B1.5 mL，共3 mL，覆盖两膜总面积约24 cm²，室温反应1分钟，确保整个有效面均被液体覆盖。
- 采5、15、30、60秒系列曝光，保留全膜原始图和饱和信息；先看PBS点及无一抗膜，再评价BSA剂量序列。
- 选无饱和、背景稳定的同一曝光做积分强度比较，使用一致大小ROI和附近背景区；若高点饱和，只能缩小使用范围或重测，不能对饱和点算线性。
09结果判断与质控
主膜四级点样应在一定范围随BSA质量增加而增强，PBS点和无一抗膜接近背景。点样大小差异、边缘环状沉积会影响定量，本练习只证明该抗体对在这类纯化样本上有可检测反应，不能证明复杂裂解物中的特异靶标身份。
10实验记录模板
| 膜号/点位 | BSA μg/mL | 体积μL/质量ng | 一抗/二抗批次与倍数 | 曝光秒 | 原始强度/背景 | 饱和 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 2/待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
11常见问题与排错
无一抗膜也很亮
查二抗直接结合、封闭和洗涤，降低二抗并复测，不能用主膜减对照膜后忽略背景。
全部无点
先看已知阳性BSA、一抗对及ECL，不立即增加未知样本量。
高浓度点反而变白
怀疑饱和或底物耗尽，降低点样量及曝光重新验证。
12参考资料
- Mahmood & Yang：免疫检测、封闭与信号局限。
- Pierce ECL #32106。BSA剂量、点样体积及抗体稀释为本地已验证抗体对的教学起始设计，非任意商品的统一说明书。
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做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。