01本篇适用条件
非致病实验室GS115，使用带无害教学插入的pPICZ（不含α分泌信号）及无DNA对照。500 mL YPD制感受态，80 μL/杯，10 μg已线性化并纯化DNA；只做整合克隆与连接处PCR，不进行甲醇诱导或蛋白表达。
02实验原理
线性化载体通过同源重组形成可筛选的整合子。山梨醇帮助电击后恢复，Zeocin在含盐/培养基条件不合适时失去选择效果；高抗性并不等同于高拷贝或高表达。
保留原EasySelect流程全部节点。本文终点是转化子筛选与整合验证，图中后续Mut表型及表达筛选是上下游背景，不代表本文已完成蛋白表达，也不将S. cerevisiae条件套入Pichia。
03安全与适用范围
由接受高压仪器培训者操作，保持杯架干燥；仅用非致病GS115与无害插入。Zeocin按SDS防护并避光保存，含药平板/培养废物分类收集。本篇不含甲醇培养或动物材料。
04材料与仪器
- GS115、YPD、无菌1 M山梨醇、pPICZ线性化DNA1 μg/μL、Zeocin100 mg/mL储备液、YPDS平板。
- 2 L摇瓶、4°C离心机与大容量转子、2 mm电击杯及脉冲仪；5′/3′整合连接处检测引物。
05配液与用量
| 项目 | 本例配制/用量 | 核对点 |
|---|---|---|
| 1 M山梨醇，1 L | 2 M母液500 mL，加水至1 L | 无菌；冰冷 |
| YPDS+Zeocin，100 mL | 酵母提取物1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖2 g、山梨醇18.22 g、琼脂2 g，水至100 mL；冷却后加100 μL100 mg/mL Zeocin | 山梨醇1 M；Zeocin100 μg/mL；山梨醇摩尔质量182.17 g/mol |
| 每次电击 | 80 μL细胞+10 μL DNA1 μg/μL | DNA10 μg；阴性加10 μL水 |
| 复苏 | 每杯1 mL冰冷1 M山梨醇 | 30°C静置1–2小时 |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 预计时间 |
|---|---|---|
| 培养 | 30°C | 5 mL过夜+500 mL过夜 |
| 洗涤 | 4°C、1500×g5分钟 | 约1小时 |
| 电击/复苏 | 2 mm杯；30°C静置 | 1–2小时 |
| 选择 | 30°C | 3–10天 |
07开始前的准备
确认pPICZ的插入和线性化位置已测序/酶切核对，完整线性化后去盐溶于水。手册要求按酿酒酵母仪器设定电击，本例采用旧手册常用1.5 kV/25 μF/200 Ω并明确为需本机正控确认的参数；不拿EBY100的2.5 kV套入GS115。
保留非分泌型pPICZ完整环图、MCS、c-myc/6×His、终止密码子、引物及元件坐标；A/B/C在克隆区读框不同。本文采用pPICZ，不用带α因子分泌信号的pPICZα；实际构建以测序版本为准。
保留pPICZ A克隆区所有行、位点和引物方向。原图是未插入载体序列，不等于本文重组体测序；跨接头PCR及实际读框仍须按本次构建重新核对。
完整保留pPICZ B克隆区作为A/B/C变体比较；本文若采用A型，不能直接复制B型接头或按B型坐标计算扩增片段。
完整保留pPICZ C克隆区作为A/B/C变体比较；本文若采用A型，不能直接复制C型接头或按C型坐标计算扩增片段。
08逐步操作
- 挑GS115单菌落入5 mL YPD，30°C通气培养过夜；记录亲本Zeocin敏感性检查。
- 取0.1–0.5 mL种子接入500 mL YPD，在2 L摇瓶30°C培养至OD6001.3–1.5。
- 培养物4°C、1500×g离心5分钟，弃上清，用500 mL冰冷无菌水完全重悬。
- 同条件离心，弃上清，以250 mL冰水重悬，再离心收菌。
- 用20 mL冰冷1 M山梨醇重悬，1500×g、4°C离心5分钟，弃上清。
- 用1 mL山梨醇重悬，使含细胞最终体积约1.5 mL；全程冰上，当天使用。
- 每反应取80 μL细胞，加10 μL对应线性化pPICZ或无菌水；另设此前在本机成功的同体系线性化载体阳性。
- 转至冰冷2 mm杯，冰上5分钟，轻敲去泡，彻底擦干杯外壁。
- 本机经同体系阳性确认后施加1.5 kV、25 μF、200 Ω单次指数衰减脉冲，记录实际ms及电弧；若正控未验证，先完成小批质控。
- 立即加1 mL冰冷1 M山梨醇，温和吸排转至无菌15 mL管，30°C不振荡恢复1–2小时。
- 将每组10、25、50、100及200 μL分别涂到标记好的YPDS/Zeocin100 μg/mL板，保持低密度。
- 30°C培养3–10天，每日观察并记首现菌落日；不能第2天无菌落就擅自提高药物或宣布阴性。
- 挑10–20个独立菌落在新选择板复划纯化，建立原始板位对应表。
- 用亲本、已知整合株及无模板对照检查5′/3′整合连接处PCR；本例给定引物与预期片段的验证表由载体图谱逐一计算。
- 仅保留两连接处一致、单克隆清楚者；登记基因型，按本单位酵母保存方式建库，记录没有验证的拷贝数及表达量。
09结果判断与质控
无DNA板无菌落、阳性有菌落才可解释样本。抗性及连接处PCR支持整合，但不能单独排除额外随机整合；后续研究需拷贝数/结构确认。本机电参数未用正控核准时，本篇属于待完成本地验证的进阶路线。
保留线性载体、同源重组位置、宿主位点和整合后表达盒全图。抗性菌落本身不能证明正确位点或单拷贝；须结合两端接头PCR，必要时测序及独立拷贝数检测。
完整保留第一次、第二次和后续整合事件。该图解释为什么耐药强度或普通插入PCR不能单独证明单拷贝；本文不把抗性水平换算成拷贝数，也不执行图外的表达诱导。
10实验记录模板
| GS115批次/OD | DNA线性化位点/μg | 杯与设置/实际ms | 复苏起止 | Zeocin批次 | 各体积菌落数 | 两连接处PCR | 未验证项目 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 | 待填 |
另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。
11常见问题与排错
阴性长菌
查亲本药敏、Zeocin保存和培养基；不要只靠提高药量补救。
无菌落
先查阳性、感受态是否储存及电弧，再查DNA线性化。
克隆基因型混杂
复划后重复两端连接处检测；抗性不能代替整合结构核验。
12参考资料
- 旧网络手册物理第70–71页：GS115和1.5 kV参数线索，不沿用高抗性等于高表达及保存感受态经验。
- Thermo Fisher Scientific，EasySelect Pichia Expression Kit User Manual，已读物理第35–36、64页，查阅2026-11-02（Asia/Taipei）：500 mL、OD1.3–1.5、1500×g、80 μL细胞、5–10 μg线性DNA、1–2小时恢复、100 μg/mL选择及3–10天培养；仪器电压仍须本机正控验证。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。