PI 细胞周期：70%乙醇固定、RNase染色和单细胞门

02实验原理

乙醇使细胞固定并通透，RNase减少RNA对PI信号的贡献；PI强度用于DNA含量分布。最常见错误是细胞团导致假4N，以及用对数显示拟合周期。保留双联体排除门、线性DNA信号和原始FCS，样本间细胞数与染色条件保持一致。

04材料与仪器

HeLa每管约1×10⁶细胞；冷PBS、无水乙醇、F10797原液、15mL管和流式管；−20°C储存条件；离心机、可用488nm激发和PI通道的流式仪；未处理参照和未染固定对照。

05配液与用量

若使用95%乙醇，不能700µL+300µL仍称70%；本例限定无水乙醇。不要以70%乙醇700µL再加PBS300µL，那样最终只有49%。

06时间安排

07开始前的准备

各样本从相同起始密度和传代范围开始，处理时间固定。准备一份健康未处理细胞作主峰参考；仪器当天质控合格。70%乙醇−20°C至少2小时是本页固定教学设置，F10797说明允许适当固定方法，其示例采用70%乙醇。

08逐步操作

1. 拍照记录状态，合并培养上清与温和解离的细胞，不丢弃处理后漂浮细胞。
2. 取样计数，每组取约1×10⁶细胞，室温200×g离心5分钟；该收集条件为待本室验证设置。
3. 以1mL PBS重悬，重复200×g5分钟洗一次，尽量除去血清与消化液。
4. 弃上清，用300µL冷PBS将沉淀完全吹散，肉眼不应见大团块。
5. 一边轻柔连续混匀，一边缓慢滴加700µL−20°C无水乙醇，最终70%；不能把细胞沉淀直接泡入乙醇形成硬团。
6. 在−20°C固定至少2小时；若统一过夜，记录所有样本实际起止，不随意混用不同固定时长。
7. 固定后以500×g室温离心5分钟回收细胞，缓慢吸去乙醇上清。以1mL PBS重悬并同条件离心，再按相同方法洗1次，共完成2次PBS洗涤。
8. 检查是否有细胞团，轻柔吹散；仍有明显团块时可经相容40µm滤网处理，记录过滤及回收损失，不用高强度涡旋打碎核。
9. 弃洗液，给每管加入500µL F10797，轻混，室温避光30分钟；落在厂家15–30分钟窗口内。
10. 染后不洗、不再加乙醇；用488nm激发和合适PI通道（如585/42或仪器等效配置）采集，DNA参数使用线性尺度。

    

11. 先排除明显碎片，再用PI面积与宽度/高度排除双联体，保持各组一致，低流速采集至少2万个合格单细胞事件。
12. 用同一模型拟合G0/G1、S、G2/M，查看拟合残差和主峰CV，并保留sub-G1与异常多峰记录；多峰不清时不能硬套出精确百分比。未达到事件目标或主峰受损的管保留失败记录，不只导出软件给出的百分比表。

09结果判断与质控

正常数据应有可识别主峰和约双DNA含量峰，中间分布对应S期。例：G0/G1 55%、S 30%、G2/M 15%，总和100%；双联体未去净时G2/M可能假升高。sub-G1可提示低DNA事件，但不能单独等同凋亡比例，需结合Annexin或其他终点。

10实验记录模板

11常见问题与排错

主峰宽：查团块、细胞数不一致、残留乙醇和仪器流速。假4N高：检查双联体门而非直接宣布G2阻滞。所有样本信号弱：核对是否误稀释即用液、PI探测器和增益，不能仅靠提高电压使图形相似。

12参考资料

• Invitrogen：FxCycle PI/RNase F10797官方手册，已读取每样本约1×10⁶细胞、0.5mL即用染液、室温15–30分钟、不洗直接上机与线性DNA分析。
• ATCC：HeLa CCL-2。固定至少2小时、离心及事件数是本页教学设置。