PCR产物柱纯化：GeneJET K0701 的50 μL示例

02实验原理

DNA在配套结合液环境吸附硅胶膜，杂质经洗液移除，低盐Tris洗脱。提高浓度不等于提高回收总量；回收率需要纯化前后DNA质量作比较，并且测量方式一致。纯化前PCR反应中的游离引物和核苷酸会干扰直接吸光度，因此不能把粗反应A260换算出的总量当作准确DNA输入。若需比较回收效率，应使用对目标双链DNA适用的测量或可靠标准，而不是把两种不可比读数硬相除；保留未纯化小份可以帮助判别损失发生在哪一段。

04材料与仪器

• GeneJET K0701：Binding Buffer、Wash Buffer浓缩液、10 mM Tris-HCl pH8.5 Elution Buffer及柱。
• 50 μL已确认的PCR产物、96–100%乙醇、必要时3 M醋酸钠pH5.2。
• 可设13000×g的离心机、移液器、干净1.5 mL管、DNA定量设备和分析电泳设备。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

核对柱容量不超过25 μg，PCR目标约1 kb，不含大量非特异条带。首次使用按K0701瓶签加45 mL乙醇到9 mL洗液浓缩液，打勾并记日期。结合液若有沉淀，37°C温热溶解后冷回25°C。准备一个仅含50 μL水的过程空白，与样本并行走同样步骤。

08逐步操作

1. 标记样本原管、洗脱管和过程空白，记录PCR编号、预计长度、反应体积及纯化前检查图。
2. 向50 μL PCR中加50 μL Binding Buffer，轻吹打8次；空白为水50 μL加结合液50 μL。
3. 查看颜色应为黄色。橙或紫色时加10 μL 3 M醋酸钠pH5.2并混匀；若仍异常，停止排查，不反复无记录加酸。
4. 将100 μL或加过醋酸钠的110 μL混液全部加至柱膜上，柱置收集管；本例远低于一次800 μL上柱上限。
5. 室温13000×g离心1分钟，弃流出液，柱装回原收集管。若液体未通过，先查堵塞或离心设置。
6. 加700 μL已含乙醇的工作洗液，13000×g离心1分钟，倒尽流出液，避免柱底接触积液。
7. 空柱再13000×g离心1分钟去残余乙醇；不能为赶时间省去此步，否则会干扰后续酶反应。
8. 将柱转入标好的新1.5 mL管，沿膜中央加50 μL Elution Buffer，枪头不要刺膜。
9. 13000×g离心1分钟，收集洗脱液，记录实际体积；本例1 kb片段不需65°C预热选项。
10. 用相同洗脱液作空白进行DNA定量，优先用双链DNA荧光法评估低量样本；记录浓度及所用测量下限。
11. 用回收液2 μL、水8 μL及6×上样液2 μL配12 μL，取10 μL做适合1 kb的分析电泳，带ladder和过程空白，确认主要片段未变。
12. 总量=浓度×实测体积；仅当纯化前质量同样经过可靠测量时才算回收率。若空白有DNA或目标带，暂停后续使用并查污染。
13. 当天使用可短时冰上，长期分装−20°C，标签写样本号、长度、浓度、总量和洗脱缓冲液，保存图像与批次记录。

09结果判断与质控

目标应仍为预计约1 kb产物，过程空白无可检DNA，洗脱液无明显抑制物。A260/A280或单一条带不能证明序列正确。出现多片段时本柱不会自动留下正确那一条，需重新选择分离策略。

10实验记录模板

11常见问题与排错

浓度低

先看输入总量及回收总量，不只看洗脱浓度；核对结合液比例、颜色和乙醇。

下游酶反应失败

先查残留乙醇，确认空转和柱底不接触废液；不要盲目增加DNA体积。

小片段损失

本例1 kb条件不是所有长度通用，≤500 bp按该手册专门验证，二聚体也可能被保留。

12参考资料

• GeneJET PCR Purification Kit MAN0012662 Rev.B：已核对1:1结合、颜色处理、700 μL洗涤、空转、50 μL洗脱及>12000×g条件。本文固定13000×g、1分钟。