PCR分型入门：用两种非编码教学等位片段练习判型

02实验原理

分型比“有无一条PCR带”多了明确的类别定义和已知类型对照。某一等位模板扩增失败可导致假单型，因此双模板阳性、单模板对照、NTC和待测重复一起判断，失败时报告未定型而非硬选类别。

04材料与仪器

• 5 U/μL普通Taq及配套含Mg²⁺10×buffer、每种10 mM dNTP、各10 μM的预验证引物。
• 已知A/B各2 ng/μL储备液、未知教学样本2 ng/μL、水、PCR管和仪器。
• 2%TAE琼脂糖胶、100 bp ladder、6×loading dye、兼容染料与带防护成像系统。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

六管为A、B、A+B、未知U1、同未知U2、NTC。判型规则先写：仅200 bp对应A类，仅350 bp对应B类，两带对应混合类，无带或其他情况为未定型。该规则只适合已确认这两类合成模板，不推广到任意真实基因。检查未知输入在已验证范围，缓冲液Mg²⁺组成从实际瓶签记录。

08逐步操作

1. 核对A/B及未知编号，准备六支PCR管和完整板图；把已知类别资料与未知身份分开记录，避免按预期结果补标签。
2. 将A10 μL和B10 μL配为双模板对照，混匀。单模板A、B均保持2 ng/μL，未知统一到2 ng/μL。
3. 冰上解冻并混匀非酶组分，短暂收液；Taq最后取出，轻弹混匀，勿在室温久放。
4. 配十份共享液：水184 μL、buffer25 μL、dNTP5 μL、Taq1 μL，轻吹打混匀，合计215 μL；多配量用于避免0.1 μL单独移液。
5. 六管各加F1.25 μL、R1.25 μL，再分21.5 μL共享液。每管此时24 μL，逐管勾选。
6. 先NTC加水1 μL，再给U1/U2各加同一未知1 μL，最后A、B、A+B各加对应模板1 μL；盖紧并换过滤头。
7. 轻混后短暂离心收液，PCR仪设25 μL，输入94°C2分钟、30循环94°C30秒/55°C30秒/72°C1分钟、72°C5分钟、4°C保持。
8. 保存程序并运行，结束把反应送到后扩增区；任何中断或程序误设都记录，不能当完整反应解释。
9. 各取产物5 μL、水5 μL、6×loading dye2 μL，共12 μL，取10 μL上2%TAE胶；固定泳道为100 bp ladder、A、B、A+B、U1、U2、NTC。
10. 用约5 V/cm运行，按本装置两电极间距计算总电压；前沿到胶长约75%停电，断开后取胶成像，保留全胶图。
11. 先检查A为200 bp、B为350 bp、A+B两带都可见、NTC无对应带；任一对照失败，则整批未知暂停判型。
12. 对照合格且U1/U2一致时按预设规则分类；重复不同、有杂带或无带写未定型，查模板和反应再重做，不据一条较强带判型。
13. 需要真实生物样本分型时，必须另有内控位点、等位特异验证及必要测序；本次教学分类只报告合成模板类别，保存全部原始结果和未定型原因。

09结果判断与质控

能对盲法教学模板给出与已知类别相符且重复一致的分类，才完成练习。双模板对照缺一带意味着可能存在等位扩增偏倚，不能继续将未知单带当作可靠单型。此实验没有验证真实基因组的基因型、拷贝数或遗传关系。

10实验记录模板

11常见问题与排错

双模板仅一条带

可能存在模板比例、长度偏倚或反应条件问题，先修复混合对照，不把它改标成单模板。

未知完全无带

检查阳性、模板质量和抑制物；真实分型需内控，不能直接判某等位缺失。

NTC出现目标带

停批、清洁前扩增区并更换工作液复做。

12参考资料

• Addgene PCR：普通Taq反应及程序原则，本文25 μL体积按比例核算。
• A/B长度和55°C退火均为教学材料必须已有的验证条件，实际引物/序列资料应附在本次记录，不声称适用于任何未验证位点。