重叠延伸SOE-PCR：600与800 bp教学片段融合

02实验原理

一片段的3′端能与另一片段的互补重叠区退火并延伸。先无外侧引物8循环生成全长，再取少量进入有外侧引物的新反应；内引物必须先清除，防止残留单片段继续扩增。24 bp重叠区Tm须支持58°C起点，长度本身不保证有效。

04材料与仪器

• 两段已验证模板、外侧F/R与含24 bp重叠尾的两条内引物、GoTaq G2 Colorless体系。
• 清理及胶回收装置、Tris、DNA荧光定量、1%胶与梯；PCR仪、洁净分装区。
• 单片段A、B及无模板/无重叠对照。

05配液与用量

100 μM引物工作液以10 μL储备加90 μL水配成10 μM。N管共用混液按N×1.1份配，模板不加入混液；每管分24 μL再加1 μL模板/水。

06时间安排

07开始前的准备

画出连接方向与阅读框，确认重叠区为同一24 bp而不是两段无关尾。分别模拟600、800和1376 bp产物，记录交界处完整序列。片段等摩尔配对，不能照抄旧文“各取5–10 μL”而不看浓度。本例普通Taq引入突变和非模板A尾的风险以最终测序管理。

08逐步操作

1. 核对四条初次引物方向及24 bp重叠序列，写下两片段和融合产物预期长度。
2. 分别按25 μL常规表配A、B初次PCR，各加1 ng无害模板，并各设NTC。
3. 运行95°C2分钟；30循环95°C30秒/58°C30秒/72°C分别40或50秒；72°C5分钟。
4. 用3 μL检查A/B及NTC，单带且NTC干净后分别净化；有杂带先按目标大小分离。
5. 将A/B以同法定量，分别稀释到10 ng/μL，保留输入胶图与浓度记录。
6. 配无引物融合管：A3 μL、B4 μL及表中酶体系补至25 μL；另配仅A、仅B两管同量反应。
7. 无引物管运行95°C2分钟；8循环95°C30秒、58°C30秒、72°C90秒，4°C暂存。
8. 在产物区取无引物轮1 μL进入新的25 μL外F/R反应；A-only、B-only与新NTC并行，器材不返回洁净区。
9. 运行95°C2分钟；25循环95°C30秒、58°C30秒、72°C90秒；72°C5分钟。
10. 各取5 μL上1%胶，5 V/cm分离1376、800、600 bp，保存完整对照图。
11. 回收A+B特有的1376 bp带，净化并定量，记录体积和回收质量。
12. 双向测序覆盖整个融合片段及24 bp交界，检查缺失、重复、阅读框和点突变；无法覆盖时增加内部测序引物。
13. 只把序列完全符合设计的产物或后续克隆标为正确，保留所有对照和原始序列。

09结果判断与质控

A+B应有1376 bp，NTC及单片段对照不应有该带。单带只是大小证据；接头可能重复/错配，必须测序。更大融合、多个片段或高GC不能直接沿用本例延伸时间。

10实验记录模板

11常见问题与排错

两单片段有、融合无

检查24 bp方向与Tm、残留内引物及等摩尔比例，再调整重叠退火条件。

多带

减少外轮模板与循环，检查片段纯度；不能仅挑最亮非预期带。

序列错

重做并使用已核验高保真体系，普通Taq产物不能凭胶带代替全长测序。

12参考资料

• 用户提供网络手册物理第31–36、39页：读取SOE、FAQ及Fusion例，纠正把EcoRI归为Ⅱs酶和不核算重叠长度等问题；不导入抗体片段实例。
• OpenWetWare，PCR Overlap Extension，2011-12-22版，实际全文查阅2026-11-02：核对互补重叠、等摩尔净化片段、无引物轮与外引物轮、最终测序；其特定聚合酶禁用建议不跨酶泛化。
• Promega，GoTaq G2 DNA Polymerase Product Information，9PIM784，修订03/18：已读50 μL体系、1.5 mM MgCl₂、0.2 mM各dNTP、0.1–1 μM引物、约1分钟/kb延伸及25–30循环；本文按体积减半，保留相同酶浓度。