核酸紫外定量：1 cm石英比色皿测纯化双链DNA

02实验原理

纯双链DNA在260 nm有吸收，以1 cm光程A260=1约对应50 μg/mL估算。RNA、游离核苷酸和污染物也吸光，因此本法不具双链DNA专一性。230–320 nm谱图和同基质空白帮助发现异常，A260/280及A260/230是筛查指标，不能单独证明DNA完整或适用于PCR。

04材料与仪器

• 纯化教学双链DNA、同批10 mM Tris-HCl pH8.0溶剂、独立已知浓度双链DNA检查液（预计读数处于线性范围）。
• 1 cm石英比色皿、紫外分光光度计，可读230、260、280、320 nm并导出谱图。
• P20/P200/P1000、清洁低吸附管、擦镜纸、洁净水和适合比色皿的清洗工具。

05配液与用量

本例采用D20和D40，需原样50 μL，另备10 μL余量；先测完D20再配D40，以保证测量体积。原样500 ng/μL时，D20理论A260约0.50，D40约0.25，均落在一般0.1–1.0吸光度区间；以本仪器线性范围为准。

06时间安排

07开始前的准备

确认比色皿光程标为1 cm，最低工作量适用1 mL并能覆盖光束。若实际最小量3 mL，应按比例重算所有体积，不能在3 mL皿里只放1 mL硬测。检查仪器性能及波长设置，预先写出D20/D40两个稀释倍数。检查液浓度须来自可追溯标定或适用独立定量，不能用同一次未知读数反过来定义检查液。

08逐步操作

1. 记录仪器、光程和比色皿编号，按说明书完成预热与性能检查；核实1 cm石英皿，普通塑料皿不得进入该UV测定。
2. 将同基质溶剂和DNA恢复至相近室温，轻颠倒混匀，短暂离心使液体回到底部；有可见颗粒先记录，不直接假定为DNA。
3. 在D20管加950 μL溶剂，再加50 μL原样，盖好颠倒10次并轻吹打混匀，记录总量1000 μL。
4. 在D40管预加500 μL溶剂，盖好留待第9步；暂不从D20取液，保证D20有足够的1 mL用于测量。
5. 将洁净皿用溶剂润洗，加1 mL同基质空白，擦净光面、去气泡，固定方向放入，做230–320 nm空白扫描。
6. 再读一份独立空白，确认谱线接近零并符合本仪器重复性要求；异常先清洗和重做空白，不继续扣除巨大背景。
7. 测已知双链DNA检查液并按其稀释倍数回算；本次可预设标称浓度80%–120%为教学检查线，超线先排查仪器与空白。
8. 用少量D20润洗，加入D20 1 mL，确保液面覆盖光束，扫230–320 nm并记录A230、A260、A280、A320；固定方向连续读两次，不把它们当独立样本重复。
9. 将D20测液转至本次专用洁净留存管，再取500 μL加入第4步已预加500 μL溶剂的D40管，混匀；洗净皿后以D40润洗并测1 mL，记录相同波长。
10. 确认软件是否已经做基线或浑浊修正；若没有，以A260−A320估算净吸光度；不要对已校正数据重复扣减。
11. 按原样浓度ng/μL=(A260−A320)×50×稀释倍数计算。例如D20净A260=0.40，则原样400 ng/μL。
12. 如使用同一基线修正，计算(A260−A320)/(A280−A320)与(A260−A320)/(A230−A320)，保留全谱；分母接近零或净A260太低时不报告稳定的纯度结论。
13. 清洗后再测同基质空白检查携带污染；空白漂移明显时重洗重测受影响样本，保留前后原始谱图。
14. 报告两个稀释回算值、基线处理、实际光程和浓度估算，重要低量或混合核酸样本用双链DNA荧光法复核；清洁比色皿并保存记录。

09结果判断与质控

检查液在本次教学线内、空白稳定且两个稀释回算接近，可报告UV估计浓度。比如D20净A260=0.40、D40为0.20，均回算400 ng/μL；若原样尚余100 μL，则估计总量40 μg。A260/230低可能提示污染，但不能单凭谱图确定是哪一种；不因A260/280合格就称DNA“无污染”或“无降解”。

10实验记录模板

11常见问题与排错

A320较高

查气泡、浑浊、指纹和颗粒，清洁并重测；明显散射时简单扣A320未必足够，应改善样本后复核。

低浓度比值跳动

接近背景时分母误差可主导比值；采用更合适光程或灵敏荧光法，勿只挑某次“1.8”的读数。

UV浓度高于荧光结果

查RNA、核苷酸和其他吸光污染，比较检测对象差异；不是任意选较高浓度报告。

12参考资料

• 用户提供《分子生物学实验手册 来源网络仅供参考》PDF物理第7页：1 cm光程及50 μg/mL换算线索；不照搬以单一比值直接诊断污染的断言。
• Promega，How Do I Determine the Concentration, Yield and Purity of a DNA Sample?，查阅日期2026-11-02：已核对UV透明皿、一般0.1–1.0读数范围、A320修正、50 μg/mL系数及非特异吸光局限；本文双稀释、检查液与表格为教学设置。