MTT终点代谢活性：96孔板细胞数范围核验

02实验原理

活细胞把MTT还原为不溶甲臜，经专用溶解/终止液溶解后读570 nm。信号反映细胞数与每细胞代谢综合变化，不能直接等同增殖、死亡比例或线粒体单一酶活；本次验证适宜起始细胞数。

04材料与仪器

NIH/3T3、适用完全培养基、CellTiter 96 Non-Radioactive MTT染液及溶解/终止液、透明96孔培养板、计数设备、37°C5%CO₂培养箱、570 nm及可选650 nm读板仪、多道移液器。

05配液与用量

每孔100 μL，15孔共需MTT染液225 μL，取270 μL作20%余量；溶解/终止液100 μL/孔共1.5 mL，取1.8 mL。每孔终总体积100+15+100=215 μL。

06时间安排

07开始前的准备

预设板图使用内侧孔并对其余外周孔加无菌PBS减蒸发，PBS孔不纳入读数。记录活细胞浓度与活率，母液混匀后立即逐组配制。空白应含同批培养基、染液和终止液。此处不设高毒药物作为“死亡对照”，避免给新手引入不必要化学暴露。

08逐步操作

1. 收获对数期细胞，按已验证计数法测活细胞浓度，调成2×10⁵活细胞/mL。
2. 按表分别配四档细胞悬液，每档1 mL；配完轻混，及时加入各3孔，每孔100 μL。
3. 无细胞3孔加100 μL相同培养基，核对板图；外周PBS孔单独标记不参与分析。
4. 37°C、5%CO₂培养18–24小时，明场记录贴壁、融合度及污染。
5. 将MTT染液轻混至均一，取270 μL工作份，按一致顺序向15孔各加15 μL，含所有空白孔。
6. 轻摇板使染液分散，记录首末孔加液时间，37°C、5%CO₂避光反应4小时。
7. 反应中不吸除培养液；4小时后在通风位置向每孔直接加100 μL专用溶解/终止液。
8. 室温放1小时，用多道移液器轻柔混匀使甲臜充分溶解，避免气泡和邻孔飞溅。
9. 检查孔底无结晶，若未完全溶解，可在密封保湿容器放置过夜再读；所有组采用相同溶解时长。
10. 设570 nm及可选650 nm参考波长，清洁板底、去明显气泡，保存每孔原始吸光值。
11. 先求各孔A570−A650（无参考时仅A570），再扣无细胞空白均值，计算各组均值与重复孔变异。
12. 以起始细胞数为横轴、扣空白信号为纵轴作图，识别随细胞数递增且未进入平台的范围，不强制全范围线性。
13. 记录适合后续实验的起始密度及限制；如用于处理组比较，另设同细胞数载体对照及无细胞处理物干扰孔。

09结果判断与质控

应观察到一段随起始细胞数增大的信号范围，过密或不足溶解会破坏关系。本次曲线不能把后续不同处理的吸光度换算成绝对细胞数。相对代谢活性=(处理扣空白信号/同板载体对照扣空白信号)×100%，报告为MTT代谢活性。

10实验记录模板

11常见问题与排错

有结晶：延长一致的溶解时间并轻混，不直接丢掉固体读上清。无细胞空白高：检查培养基颜色、试剂污染及有色处理物。最高细胞数组信号平台：减小起始数或反应时间并重新验证，不能外推。

12参考资料

旧来源：网络手册物理201页。现代核对：Promega，CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay，Technical Bulletin TB112，修订2012-12，正文1、3B及4B小节，查阅2026-11-02。采用100 μL体系加15 μL染液、37°C4小时、加100 μL溶解/终止液、1小时混匀/可选过夜、570 nm与630–750 nm参考；修正旧文把还原局限于单一线粒体酶及把0–0.7当通用线性范围。