Matrigel Transwell 侵袭：包胶与无胶配对怎样做

02实验原理

胶层增加了跨膜前的基质屏障，终点同时受基质降解、运动、存活和黏附影响。至少设置有胶+梯度、无胶+梯度、有胶+无梯度三组，各3膜；无胶组用同批细胞、相同时间和相同上下载液。先求每膜计数，再做有胶与无胶的组间比值，分母接近零则不计算。

04材料与仪器

Corning354234一批及批次蛋白浓度证书；Corning3422小室9个；HeLa单细胞液；EMEM、FBS、BSA、无钙镁PBS；预冷枪头与管、冰盒；商业4%甲醛液、0.1%结晶紫液、湿棉签、显微镜。

05配液与用量

若原胶浓度8mg/mL，配1mL工作液所需体积=0.30×1÷8=0.0375mL=37.5µL，再加962.5µL冷EMEM。不能固定取30µL而无视批次差异。

06时间安排

07开始前的准备

首次比较15、30、60µg/膜及12、24小时窗口，选有胶组可计数且无胶组不成片的组合。记录胶批号和真实mg/mL，避免反复冻融；冰上完成稀释，吸取时不产生气泡。本例100µL低浓度包被形成的是薄基质层，不应宣称为厂家保证的厚凝胶结构。应预试确认洗去游离液后仍有均匀基质保留且产生可重复屏障；若不能确认，只报告基质包被膜迁移，不把它等同侵袭。

08逐步操作

1. 将354234按本批储存要求从低温转至4°C过夜融化，工作时保持在冰上，不能用37°C水浴快速化胶。
2. 核对证书蛋白浓度，按C₁V₁=C₂V₂配1mL、0.30mg/mL工作液，使用预冷枪头缓慢混匀，记录计算与批号。
3. 给6个有胶小室各加100µL胶工作液，轻移覆盖膜；另外3个无胶小室加100µL无血清EMEM作同等处理。
4. 放37°C培养箱1小时使薄层包被；此时间是教学起点。接种前缓慢吸去仍可移动的游离液，不刮膜、不把已形成层吹散，也不让膜干燥。
5. 在梯度组下孔加600µL完全培养液，无梯度组下孔加600µL0.1%BSA上室液，放入对应小室，检查膜下无气泡。
6. 从同一批HeLa收获单细胞，洗去残余血清后计数，重悬至5×10⁵活细胞/mL；各组都记录活率。
7. 每小室上室沿壁加入100µL细胞液，5×10⁴活细胞；枪头不接触胶层，立即开始24小时计时。
8. 37°C、5%CO₂培养，终点时同步收取有胶、无胶和无梯度各组，不给难迁移组单独延长时间。
9. 温和PBS洗一次，膜两侧接触4%甲醛：下孔600µL、上室100µL，室温固定15分钟，随后PBS洗3次。
10. 膜两侧用0.1%结晶紫同体积室温染20分钟，温和洗去浮色；用湿棉签清除上表面的残胶和未穿膜细胞，不能擦掉膜下细胞。
11. 按每膜中心与四周共5个固定面积视野拍照，计膜下完整细胞；保留上表面是否清除干净的备注。
12. 先求每膜及每组均值，侵袭相对迁移比例=有胶梯度组均值÷无胶梯度组均值×100%；同时报告两个原始计数与无梯度背景，不只给一个百分比。

09结果判断与质控

例如有胶均值18个/视野、无胶60个/视野，比值为30%。这个比例是相同试验条件下的操作性指标，不是细胞具有30%的体内侵袭能力。无胶仅2个/视野时，比例会极不稳定，应重新建立迁移窗口后再比较。

10实验记录模板

11常见问题与排错

无胶可迁移而有胶全零：先降胶量或优化时间做新预试，不能把建立失败直接写成药效。重复离散大：查工作液是否提前成胶、膜下气泡、批次浓度和擦膜力度。胶全被吸走：检查薄层是否形成及吸液位置，不能靠加两倍细胞补救。

12参考资料

• Corning：354234 Matrigel Matrix官方产品页，已读取基质来源、蛋白组成与批次测定信息，用于基质性质与批次选择；具体包被数值为教学设置。
• Corning：3422小室官方产品资料，已读取孔径、面积及推荐体积。
• ATCC：HeLa CCL-2。本教学条件尚需细胞株与本室批次验证。