间接ELISA抗体滴度：非感染性抗OVA样本倍比稀释

02实验原理

OVA直接吸附孔壁，样本中抗OVA抗体结合后由HRP抗鼠IgG识别，TMB显色并酸终止后读450 nm。阴性IgG、无一抗与无抗原孔分别帮助识别非特异结合、二抗背景及板吸附；滴度依抗原量、二抗和阈值而变。

04材料与仪器

OVA1 mg/mL PBS储液、已知S/N及阳性抗OVA参比、透明高结合ELISA板、PBS、Tween20、BSA、HRP抗鼠IgG已验证1:5000工作稀释、即用TMB及其匹配酸终止液、450 nm/可选620–650 nm读板仪、洗板器或多道移液器。

05配液与用量

40孔安排：S8档双孔16，N8档双孔16，阳性参比2，无一抗2，无OVA+S低稀释2，无OVA+仅二抗2。36孔包OVA需3.6 mL，4个无抗原孔用100 μL PBS代替。

06时间安排

07开始前的准备

OVA与抗OVA组合需已有小试证实反应；二抗1:5000为本例预验证条件，批次更换须另做棋盘滴定。阳性参比用其已验证1:1000稀释。教学滴度阈值预设：扣无一抗背景后，样本双孔均值同时高于对应N均值+3×N技术重复标准差及0.10吸光度，且重复CV≤15%；技术双孔阈值仅教学比较，正式生物诊断需独立阴性样本定义阈值。

08逐步操作

1. 画40孔板图，标记36个OVA孔与4个无OVA孔，检查板型为高结合透明ELISA板。
2. OVA1 mg/mL储液25 μL以PBS配至5 mL，每个OVA孔加100 μL；无抗原孔加100 μL PBS，4°C封板过夜。

   

3. 次日弃包被液，PBST每孔300 μL洗3次，每次轻摇约30秒再弃净，勿使板干。
4. 各孔加200 μL1%BSA封闭液，室温1小时，随后PBST300 μL洗3次。
5. S取7.5 μL加742.5 μL稀释液成750 μL的1:100；N取5 μL加495 μL成500 μL的1:100。各自后7管先各放250 μL稀释液，按表逐级转250 μL并充分混匀。
6. 最终1:12800管也混匀，保留全部余液；S首管转出后应余500 μL，供常规双孔200 μL及无OVA双孔200 μL。其余需要转出的管至少余250 μL供常规双孔及余量。
7. 各样本孔加100 μL相应稀释液；阳性参比按验证1:1000加100 μL，无一抗孔只加稀释液。
8. 无OVA+S孔加1:100 S；无OVA仅二抗孔先加稀释液，所有孔室温封板2小时。
9. PBST每孔300 μL洗5次，最后在洁净吸水纸轻拍去残液，不能猛烈摔板。
10. 各孔加100 μL1:5000 HRP抗鼠IgG，室温1小时；再PBST300 μL洗5次。
11. 每孔按固定顺序加100 μL TMB，室温避光10分钟；若参比提前饱和立即整板统一终止并记实际时间。

    

12. 按相同顺序各孔加50 μL匹配终止液，轻摇混匀，确认蓝转黄；保护眼睛避免溅酸。
13. 终止后10分钟内读450 nm，可扣620–650 nm参考，保存全部原始值、板图及显色起止。
14. 扣无一抗背景，检查阳性参比、N、无OVA孔及双孔CV，按预设阈值找最高连续阳性稀释倍数并报告滴度。
15. 若最高档仍阳性则记录“≥1:12800”，另加更高稀释再测；若1:100也阴性报告低于本范围，不能填0抗体。

09结果判断与质控

合格批次应阳性参比可检出、阴性和无抗原低背景，S通常随稀释信号降低。终点滴度写为最高合格阳性稀释倍数的倒数，例如6400，附阈值与本条件；不得把最高OD孔直接换成mg/mL，也不与IL-6夹心标准曲线混用。

10实验记录模板

11常见问题与排错

阴性高：查封闭、二抗、洗板及样本基质，用无OVA孔区分板吸附。全部阴性：先查阳性参比与HRP/TMB，不调低阈值凑阳性。曲线反常：查倍比转移、混匀及饱和，保留原始稀释记录。

12参考资料

旧来源：网络手册物理212页、短版17页抗原包被间接ELISA；动物免疫/采血部分不导入。现代核对：Thermo Fisher Scientific，Overview of ELISA（中文版现行技术指南），查阅2026-11-02，核对高结合板、常见2–10 μg/mL包被、封闭优化、0.05%Tween清洗及HRP/TMB蓝转黄读数体系；用PBS包被及明确TMB条件替换旧碳酸盐配方不明盐型及ABTS405 nm路线。二抗/OVA教学条件须有本地预验证，正文声明边界。