手灌SDS-PAGE胶：10%分离胶与4%积层胶

02实验原理

丙烯酰胺/双丙烯酰胺由APS/TEMED引发聚合；分离胶pH8.8，积层胶pH6.8，形成Tris-甘氨酸不连续体系。不能把旧表积层胶pH8.8误当正确配方；总单体浓度和交联比例须注明。

04材料与仪器

1 mm迷你灌胶架、长短玻璃板、梳子；30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺29:1、1.5 M Tris-HCl pH8.8、0.5 M Tris-HCl pH6.8、10% SDS、新鲜10% APS、TEMED、水；1×Tris-甘氨酸-SDS运行液、2×样本缓冲液、普通蛋白标准。

05配液与用量

APS现配0.1 g加水至1 mL即10% w/v。运行液1 L：使用已验证10×Tris-甘氨酸-SDS液100 mL加水900 mL，成1×；不要用旧表错标的倍数。APS与TEMED最后加入，体积已计入总量。

06时间安排

07开始前的准备

清洗玻璃并检查边缘、垫条及密封件。梳齿底部到分离胶面留约1–1.5 cm积层区。量程小于2 μL的TEMED操作须用合适移液器；如果没有合适器具，扩大配液规模而不是估一滴。胶架立在水平面，先用水检漏再配聚合液。

08逐步操作

1. 洗净干燥玻璃板，按1 mm垫条组装，检查两侧齐平并锁紧灌胶架。
2. 向板间加水至拟灌高度，静置5分钟，检查底部及侧边；漏液则重装，合格后吸尽水。
3. 在玻璃外侧标出分离胶高度，保证梳齿下方1–1.5 cm积层空间。
4. 按5 mL配方依次混合水、Tris pH8.8、30%胶液与SDS，轻混不产生泡沫。
5. 最后加入50 μL10% APS和2 μL TEMED，立即轻混，沿板边缓慢灌入标线位置，避免夹入气泡。
6. 轻缓覆盖约0.5–1 mL水，使胶面平整隔氧；余胶留在管内作聚合指示，室温放30–45分钟。
7. 确认余胶及胶面已凝固，再吸去覆盖水并用水轻冲，吸去可见残液。
8. 按2 mL配方配积层胶基液，核对使用0.5 M Tris-HCl pH6.8。
9. 最后加20 μL10% APS与2 μL TEMED，轻混后灌至板顶，倾斜插入梳子，再摆正排除梳齿气泡。
10. 室温静置20–30分钟，确认余胶凝固，竖直缓慢拔梳，用1×运行液轻冲各孔。
11. 装入电泳槽，加入适量1×运行液，检查内槽液面5分钟不明显下降，确认密封。
12. 无害教学蛋白与2×上样液1:1混合、95°C5分钟冷却，按每道5–10 μg蛋白及适量标准上样。
13. 盖好槽盖，80 V待染料进入分离胶后改120 V；记录电流与温度，前沿距胶底约5 mm时断电。
14. 取胶进行考马斯染色及成像，评估泳道笔直、条带及气泡影响；记录配方与失败位置。

09结果判断与质控

合格胶应均一透明，无贯穿气泡，孔完整、分离胶面平直。蛋白标准能分离且无明显斜带才支持该次配胶/装槽可用；聚合本身不代表分辨率合格。30%母液29:1不能无说明换成37.5:1后声称条件完全相同。

10实验记录模板

11常见问题与排错

不凝胶：检查新鲜APS、TEMED漏加、温度及单体储存，不把TEMED盲目翻倍。斜界面：校平胶架与覆盖液。弯带：查漏液、盐负荷及温升，不能只归因样本。

12参考资料

旧来源：网络手册物理169、195–196页；短版49–51页。旧196页/短50页积层胶表错写1.5 M Tris pH8.8，本文改为0.5 M pH6.8、终125 mM；同源169页积层胶与分离胶配方也存在体积/标注不一致。现代核对：STAR Protocols，Protocol for detecting lncRNA-protein interactions in vitro by tRSA RNA pull-down assay，2024，5:102818，doi10.1016/j.xpro.2023.102818，查阅2026-11-02；核对分离pH8.8与积层pH6.8/125 mM。该文积层表APS/SDS单位及胶百分数自身不一致，未照抄；本文重新计算10%/4%不连续Laemmli配方，所有体积精确相加，不沿用四舍五入造成的总量偏差。