01本篇适用条件
以普通教学DNA的单一1 kb条带为样本，1%琼脂糖胶中每个目标胶块≤200 mg，估计输入≥200 ng。使用商业惰性滤网离心篮，或指导者已验证不吸附DNA且适配16000×g的带滤网挤胶装置；不要求新手临时扎管。同步处理同等质量不含DNA胶块B。最终30 μL重溶；本路线为冻融挤出加溶剂净化，不冒充柱法，回收效率需要实测。
02实验原理
冻结形成冰晶破坏琼脂糖网络，解冻并离心把含DNA的液体挤出。其效率受胶浓度、片段大小和装置影响，残留琼脂糖/染料再经抽提与醇沉淀处理。旧页是在胶中加酚再冻融；本文选择可监测体积的无酚冻结/挤出，再单独做有机净化，避免将难辨的胶/酚混合物当作清澈水相。
03安全与适用范围
穿实验服、护目镜并戴与SDS相容的手套；酚、氯仿均须由受训指导者在化学通风橱内带教，使用密封耐溶剂管，发生皮肤接触立即按本单位应急流程处理。含卤有机相、界面和污染枪头分别进入规定化学废物容器，不倒入水槽、不与漂白剂混合；乙醇及异丙醇远离火源。离心管和转子须适配所列×g，配平后运行，不把rpm直接视为×g。 切胶使用蓝光与配套护目罩；不用徒手暴露于UV。刀片入锐器盒。
04材料与仪器
- 已跑好的1%教学DNA凝胶、1 kb条带及相邻空白胶区，蓝光台、新刀片、已称重2 mL管。
- 经验证的离心挤胶滤篮及收集管、10 mM Tris-HCl pH8.0、pH8 PCI、氯仿:异戊醇24:1、3 M乙酸钠pH5.2、无水及70%乙醇。
- −20°C冰箱、可达16000×g离心机、DNA荧光定量、质控胶；无合格挤胶装置时先完成装置验证，不以棉花临时代用。
利用箭头辨认电极、胶槽与制胶组件，再按正文核对上样孔朝负极以及DNA迁移方向。图中设备仅为结构示例，不能照搬电源旋钮、尺寸或电压。来源为Addgene技术教程局部图，非商业推广。
05配液与用量
| 项目 | 每样本 | 核算 |
|---|---|---|
| 含DNA/空白胶块 | 100–200 mg | 减去空管质量；胶约1 mg≈1 μL，只用于体积估计 |
| 二次挤出补液 | 10 mM Tris pH8.0 50 μL | 加在第一次挤干胶上 |
| 水相调整 | 合并挤出液以Tris补至200 μL | 如实得160 μL，补40 μL |
| 有机抽提 | PCI200 μL；随后氯仿与实得水相等体积 | 不把胶质量用作第二次抽提体积 |
| 沉淀示例 | 最终V=180 μL，3 M乙酸钠18 μL、乙醇450 μL | 总648 μL |
| 洗/重溶 | 70%乙醇500 μL×2；Tris30 μL | 输入200 ng、全回收上限6.67 ng/μL |
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 时间 |
|---|---|---|
| 称胶/冻结 | −20°C，冻结至硬实 | 至少30分钟 |
| 解冻、挤胶两次 | 室温/16000×g | 20–30分钟 |
| 抽提 | 室温 | 25分钟 |
| 沉淀 | −20°C 30分钟；4°C离心20分钟 | 约1小时 |
| 重溶与QC | 室温 | 20分钟 |
07开始前的准备
保存切胶前图及同批质量参照，以估计输入量；不要用切胶后条带消失推算回收率。装置须能截留碎胶且不漏裂，先用空白胶演练。本文200 mg上限比旧文0.6 g更保守，防止过载；将S和B分开用新刀片切取。
08逐步操作
- 保存完整胶图，确认目标为约1 kb单一带，记录载入DNA质量或相邻质量标准的估算方法。
- 在蓝光下用新刀片切取最小目标胶块，去掉多余无信号胶，称净质量；另切同等质量空白胶块B。
- 将胶块放入已验证滤篮，装入匹配收集管，盖紧并标S/B；每管不超过200 mg。
- −20°C放至少30分钟，直至胶块完全冻结硬实；记录实际冻结时间，不只机械计时5分钟。
- 室温解冻约5分钟至胶变软，用洁净宽口头轻压碎成小块；避免尖端刺穿滤网。
- 16000×g、室温离心10分钟，将第一次挤出液转到新管并量体积V1。
- 在滤篮胶渣上加50 μL Tris，放5分钟，16000×g离心5分钟；合并两次液体，记V2和总量。
- 以Tris把合并液补至200 μL；若合并液超过200 μL则按实际体积做后续等体积抽提，不倒掉超量液。
- 在通风橱加入等体积PCI，盖紧颠倒1分钟，12000×g室温离心5分钟，取上层水相入新管。
- 加等体积氯仿:异戊醇，混匀并12000×g离心5分钟，再取水相，记录最终V。
- 加0.1V 3 M乙酸钠及2.5V无水乙醇，轻混，−20°C放30分钟；16000×g、4°C离心20分钟。
- 吸去上清，加500 μL70%乙醇，16000×g离心5分钟；再洗一次，吸尽可见残液。
- 室温风干5–10分钟至无液滴，加30 μL Tris，室温15分钟后轻吹混匀，不把沉淀烤成硬块。
- 定量S与B，各取相同体积做胶；报告条带大小、是否有额外带和实测回收量，再决定是否用于连接。
09结果判断与质控
成功须回收到与输入同大小的DNA且B无相应带；回收率=产物浓度×实际体积/输入质量×100%。输入质量不准确时只报估算回收率；冻融法易低回收，不能保证70%。极低量、<200 bp或较大片段不在本例验证范围内。
10实验记录模板
| 管号 | 胶mg/输入ng | 冻结起止 | V1/V2/补水μL | 最终V/盐/醇μL | 重溶μL | ng/μL/回收率 | QC胶 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| S/B | 待填 | 待填 | 待填 | V/0.1V/2.5V | 30 | 待测/待算 | 待填 |
11常见问题与排错
出液少
检查是否冻透、滤网堵塞或胶量过多；保留残胶，分批再挤，记录增加液量。
浓度很低
检查输入DNA、装置吸附和沉淀损失；本法不适合把痕量DNA回收当作必然结果。
连接失败
用未冻融同片段作阳性，排查溶剂、染料及UV损伤；大小正确不等于末端完整。
12参考资料
- 用户提供网络手册物理第8页“DNA片段回收与纯化—冻融法”：核对冻融、二次回收及有机净化历史路线。
- Addgene，Purifying Plasmid DNA，Phenol-Chloroform Extraction与Ethanol Precipitation，网页查阅2026-11-02：核对净化、分相和沉淀；本文冻结挤出为对旧法的限定小规模替代，装置与回收必须预验证。
- Addgene，Gel Purification，已获取全文，查阅2026-11-02：核对最小胶块、减少照射和后续回收质控。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。