大肠杆菌电转化：100 mL培养物与0.1 cm电击杯

02实验原理

多次低盐洗涤降低电导，短脉冲形成可逆通透性变化。电容电阻与杯间距共同决定脉冲；电压除以间距才是场强。实际时间常数由仪器读出，不能把旧文“3秒以上”用于微生物电转。

04材料与仪器

• 100 mL LB培养物、无菌超纯水、10%甘油、SOC、Amp选择平板、1 ng/μL已知完整质粒和10 ng/μL样本DNA。
• 4°C离心机、预冷转子/管、0.1 cm电击杯、可设1.8 kV/25 μF/200 Ω的脉冲仪；操作者须经电转训练。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

先把SOC放在仪器旁，核实杯间距和仪器脉冲模式。连接产物先去盐；DNA溶于水，避免直接加入酶切缓冲液。准备阳性P、样本S、无DNA N及不电击活菌对照V；四组使用同一细胞批次。

08逐步操作

1. 单菌落种子按1:100接入100 mL LB，在500 mL摇瓶37°C通气培养，OD600达到0.5–0.6时停止。
2. 菌液冰上放15分钟，4°C、3000×g离心10分钟，吸去培养基。
3. 以100 mL冰冷无菌水完全重悬，4°C、3000×g离心10分钟，弃上清。
4. 再用50 mL冰冷水重悬并按相同离心条件收菌，尽可能去掉残余含盐培养基。
5. 以20 mL冰冷10%甘油重悬并离心，继而用10 mL甘油再洗一次；全程置冰。
6. 将沉淀以10%甘油补至1 mL，轻轻混匀；每管分40 μL，立即使用。
7. 向S、P、N各加1 μL对应DNA或水，轻弹；冰上5分钟，V不加DNA、不电击。
8. 转入冰冷的0.1 cm杯，轻敲让液体覆盖杯底且无泡；擦干杯外表。
9. 关闭杯架，施加1.8 kV、25 μF、200 Ω单次脉冲，立即记录实际时间常数和是否电弧。
10. 脉冲后立即往杯内加1 mL SOC，轻吸排转入无菌管；V直接加1 mL SOC。
11. 四管37°C振荡复苏1小时；有电弧的样本单独标失败，不继续补电击。
12. P作1:100及1:1000稀释，各取100 μL上Amp板；S涂50、100 μL，N涂100 μL Amp板并另取一份稀释后涂无抗LB检电击后存活；V相同稀释涂无抗LB作为未电击活性基线。
13. 37°C倒置16–20小时后计数；效率=菌落数×稀释倍数×1041/涂板μL÷输入DNA μg。
14. 确认N无菌落且V/P有效后挑S单菌落验证，登记电转杯、仪器及DNA盐来源。

09结果判断与质控

P有转化菌落、N选择板无菌落、N非选择板有活菌且V基线正常才可解释S。约4–5 ms常见于本参数，但不把时间常数单独当成成功证据；电弧、异常短脉冲或阳性失败须重做。本文洗涤为旧法经低盐原则整理的教学批次，现代来源未直接验证该批DH5α的效率。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

电弧或短脉冲

查DNA盐、残培养基、杯外水和气泡；去盐并用新杯重做，不能反复对同一细胞补脉冲。

P无菌落但V存活

检查DNA完整性、设置与电极接触；新鲜细胞重做。

V也无活菌

查细胞培养状态、低温处理与复苏液。

12参考资料

• 旧网络手册物理第67–68、126页：低盐洗涤和0.1 cm/1.8 kV/25 μF/200 Ω线索；修正秒与毫秒、μg与mg效率单位。
• NCBI PMC，Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation，2015，PMC4354625：已读低盐、脉冲时间常数>4 ms与电转后细胞活性对照；其荧光递送条件不作为本例克隆效率验证。