DNA 乙醇沉淀：100 μL 纯化 DNA 的浓缩与洗盐

02实验原理

一价阳离子与乙醇降低DNA在水相中的溶解度，离心使DNA集中在管壁底部；70%乙醇保留沉淀并帮助去盐。加1/10原样体积的3 M乙酸钠后，乙醇加入前的水相乙酸钠为3×10/110=0.273 M，不能严格写成0.300 M；这是通用比例的近似值。

04材料与仪器

• 教学双链DNA、同溶剂空白、3 M乙酸钠pH5.2、无水乙醇、纯水、10 mM Tris-HCl pH8.0。
• 1.5 mL低吸附离心管、P20/P200/P1000、过滤枪头、管架与冰盒。
• 可设4°C和16000×g的微量离心机、−20°C冰箱、适用双链DNA的定量仪器；无准确低量定量条件时只报告浓缩体积，不编造回收率。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

按本体系计算总量2 μg，若全回收至20 μL理论上限100 ng/μL；这不代表实际回收保证。取独立原样小份作输入定量，沉淀管仍应有100 μL；输入和产物用相同适用检测法。确认转子能达到16000×g，不能把旧文献的rpm数字直接输入×g字段。将两管铰链同向朝外，便于定位沉淀。

08逐步操作

1. 标记DNA管S、空白管B及两支重溶记录位置，分别加入100 μL对应液体，核对S的输入浓度与总量。
2. 配10 mL新鲜70%乙醇，盖紧；把无水乙醇及洗液放冷备用，离心机预冷至4°C。
3. 两管各加10 μL 3 M乙酸钠pH5.2，盖好轻颠倒10次，避免漏加盐。
4. 每管加250 μL冷无水乙醇，盖紧颠倒10次，使水相与醇完全混匀；不得只在表面形成乙醇层。
5. 两管放−20°C 30分钟，记录起止时间。DNA未呈现肉眼絮状也继续按程序处理。
6. 对称配平，铰链朝外；在4°C、16000×g离心20分钟，转子完全停止后再开盖取管。
7. 保持铰链朝外，将管放回架子；用P1000缓慢吸去上清，枪头远离铰链侧底部，最后少量改用P200。
8. 沿与沉淀相反的管壁加入500 μL冷70%乙醇，轻轻倾斜使液体覆盖底部，不剧烈打散沉淀。
9. 4°C、16000×g离心5分钟，按同样方向小心吸去洗液；重复一次500 μL洗涤及5分钟离心。
10. 再短暂离心约10秒使残液到管底，用细枪头吸去可见残液，始终避开沉淀位置。
11. 在清洁处开盖室温风干5–10分钟，以无可见液滴为终点；不要加热烤干，不用鼻子靠近闻气味。
12. 每管加20 μL重溶液，盖好室温放15分钟，轻弹并缓慢吸排5次；仍有薄膜时延长浸泡，不强烈涡旋长片段DNA。
13. 用相同检测法测输入与产物，计算回收质量=产物浓度×实际重溶体积，回收率=回收质量/输入质量×100%。记录空白信号。
14. 标记DNA身份、浓度、体积及日期；当天使用可置4°C，需较长保存则分装−20°C。记录所有损失及异常，收集乙醇废液。

09结果判断与质控

期望得到可重溶的20 μL DNA，空白不应有可解释为DNA的明显信号。回收率需实测，不规定“必达70%”。高于100%的表观回收优先提示测量背景、污染或体积记录错误。若下游对盐敏感，可用小份验证酶反应，不能只凭A260/280合格就宣布去盐完成。

10实验记录模板

11常见问题与排错

沉淀不见了

先检查输入质量、盐和醇比例，沉淀不可见不等于没有DNA；保留记录并定量重溶液。

重溶困难

考虑过度干燥或盐多；延长室温浸泡并温和混匀，不用粗暴吹打掩盖问题。

下游酶反应差

查残留乙醇及盐；设置未处理的同来源DNA对照，以适合下游的净化方法处理，不能靠增加酶量无限补偿。

12参考资料

• 用户提供《分子生物学实验手册 来源网络仅供参考》PDF物理第7、51–52页：提供乙醇沉淀、盐及洗涤的历史线索；不采用其中互相矛盾的时间、rpm或肝素建议。
• Addgene，Purifying Plasmid DNA（Protocol: Ethanol Precipitation），查阅日期2026-11-02：核对2–2.5倍乙醇、1/10体积3 M乙酸钠、500 μL 70%乙醇和5–20分钟风干；本文明确用pH5.2乙酸钠、16000×g与双洗，属于在旧资料基础上限定的教学设置，不采用来源中直接倒下水或未给转子半径的rpm表述。