培养细胞基因组DNA提取：GeneJET K0721柱法

02实验原理

蛋白酶K消化、RNase去RNA后，配套裂解液和50%乙醇促使DNA结合柱膜；不同离心阶段的RCF不同。污染RNA可抬高吸光度，完整性和可扩增性还需独立检查。后续PCR统一的是DNA质量而非未经测量的等体积，先计算每份输入再做稀释。若不同样本的洗脱体积或细胞数不同，应将这些差异保留在记录中，不据浓度高低直接推断某组细胞DNA更多；细胞周期和倍性也可能影响每个细胞DNA量。

04材料与仪器

• K0721：Lysis Solution、Proteinase K、RNase A、Wash Buffer I/II、配套柱和Elution Buffer。
• 约1×10⁶细胞沉淀、1×PBS、96–100%乙醇、水、标记管。
• 56°C加热块、可设250/6000/8000/13000×g的离心机、定量和分析电泳设备。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

核对两瓶洗液已分别加入30 mL乙醇，不把PCR纯化盒9+45 mL配方用于K0721。准备过程空白：用200 μL PBS代替细胞重悬液，之后试剂和柱步骤完全相同。盐析裂解液37°C复溶，冷到25°C后用；检查细胞数未超过贴壁细胞手册2×10⁶上限。

08逐步操作

1. 标细胞编号、细胞数、采集时间和最终收集管；若细胞仍悬在PBS中，250×g离心5分钟，吸去上清。
2. 向细胞沉淀加200 μL PBS，轻吹打至无团块；过程空白管仅加200 μL PBS。
3. 各加200 μL Lysis Solution和20 μL Proteinase K，涡旋约5–10秒获得均匀悬液，盖紧。
4. 56°C孵育10分钟，期间轻混一次；应无可见细胞块。未充分裂解时先检查样本过量或酶活，记录延长情况，不带团块上柱。
5. 加20 μL RNase A，混匀，室温孵育10分钟；不要把RNase步骤误当成去DNA步骤。
6. 加400 μL新配50%乙醇，吹打或轻涡旋混匀，总约840 μL。乙醇浓度不能换成常见RNA柱用的96–100%加液方案。
7. 将混液加至GeneJET gDNA柱。若实际柱上液槽无法容纳全部840 μL，则先加600 μL，6000×g1分钟，弃流出液再加余液并同样离心；勿超液槽容量。
8. 把柱移到新2 mL收集管，加500 μL Wash Buffer I，8000×g离心1分钟，弃流出液后装回。
9. 加500 μL Wash Buffer II，13000×g离心3分钟。若仍有残液，倒掉流出液，再13000×g空转1分钟。
10. 将柱转到标记的新管，膜中央加100 μL Elution Buffer，室温静置2分钟，8000×g离心1分钟收集；记录实际体积。
11. 以相同洗脱液作空白，测双链DNA浓度及吸光度杂质线索。过程空白若有明显DNA，先查样本交叉污染与定量空白。
12. 用少量DNA做低负荷分析电泳，观察高分子信号和明显降解；另以已验证普通教学引物检查可扩增性，带阳性和NTC。吸光比值好不等于完整或可扩增。
13. 计算总量=ng/μL×实测μL，分装−20°C并记录冻融次数。若用于特定下游，确认其可接受洗脱液中的0.1 mM EDTA，必要时采用经验证缓冲交换。

09结果判断与质控

过程空白干净、DNA有可追溯总量、无严重降解且常规PCR对照有效，才称满足本教学用途。纯DNA A260/A280常约1.8，但低浓度时比值不可靠，也不能排除RNA和盐。不同细胞批次产量可变，不将厂商典型产量作为必须得到的结果。

10实验记录模板

11常见问题与排错

低产或堵柱

先查重悬与裂解、细胞过量、乙醇浓度及柱上液量，不靠强行提升RCF处理。

下游PCR受抑制

检查洗涤/空转和样本盐残留，先做适当稀释及阳性对照，不盲目加更多DNA。

260读数高但DNA荧光低

排查残余RNA和测量下限，核对RNase有效性，重新评价而非平均两种读数。

12参考资料

• GeneJET Genomic DNA Purification Kit MAN0012663：已核对培养细胞200/200/20/20/400 μL、50%乙醇、6000/8000/≥12000×g及洗脱选项。