固定染色体FISH：直接荧光探针与常规玻片路线

02实验原理

固定染色体与探针分别变性，互补序列复性定位；甲酰胺、盐和温度共同决定结合。直接荧光路线无需anti-DIG抗体；双点数目受目标、倍性、分裂相和染色体重叠影响，不能把每个荧光小点都当成真实拷贝。

04材料与仪器

• 预制中期分裂相玻片、经验证荧光DNA探针100 ng/μL、对照探针/无探针片、20×SSC、去离子甲酰胺、50%硫酸葡聚糖、RNase A1 mg/mL、乙醇、PBS、DAPI抗淬灭封片液。
• 72°C准确控温水浴、37/45°C湿盒/水浴、Coplin缸、18×18 mm盖片、橡胶封口材料、荧光显微镜与匹配滤镜。只在接收的固定玻片上操作。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

先查看DAPI试片，选染色体分散且背景干净的同批玻片。预设S、已知P、无探针N和适配目标阴性；每批相同位置面积、100 ng直接标记探针。所有探针批次必须经相同玻片阳性验证；来源现代文献对照常规法核对总体流程，旧法洗温/时长为本教学固定条件，不能承诺任意探针通用。

08逐步操作

1. 核对固定玻片编号、细胞来源、固定时间与分裂相质量，记录预选区域，排除染色体重叠严重或脱落片。
2. 按表配RNase工作液，每片加100 μL盖片覆盖，37°C湿盒1小时，N也同样处理。
3. 移去盖片，2×SSC室温洗三次各5分钟；70%、90%、100%乙醇各2分钟，空气干燥。
4. 配70%甲酰胺/2×SSC变性液，独立温度计确认72°C；准备冰冷70/90/100%乙醇缸。
5. 将玻片浸72°C变性液2分钟，立即转冰冷70%、90%、100%乙醇各5分钟，空气干燥。
6. 每片按表配10 μL实际100 ng探针杂交液；N用1 μL水替代探针，其他终体积相同。
7. 探针混合液75°C5分钟，立即置冰；短离心收集，避免重复冻融和强光。
8. 把10 μL加入目标区，盖18×18 mm盖片排泡并封边；37°C湿盒16小时，避光。
9. 预温50%甲酰胺/2×SSC至45°C，浸片松开盖片，不强撬；新液洗三次各5分钟。
10. 45°C1×SSC再洗三次各5分钟；用PBS短洗，减弱光照并避免组织/染色体面直接刮擦。
11. 吸去玻片边缘余液，加约15 μL即用DAPI抗淬灭封片液，盖片避免气泡，按该封片介质已验证固化条件保存避光。
12. 同一曝光下先采P、N和目标阴性，确认P靶位置信号及N背景，再采S的DAPI/探针通道。
13. 每张片按预定蛇形路线观察至少20个可评价分裂相，记录总数、排除数及理由，不只挑明亮视野。
14. 保存DAPI、单通道及合并原图，标明同一细胞和曝光；按探针预期定位记录，不凭亮点自动下拷贝诊断。
15. 若P失败或N背景同样亮，整批标不可解释；调整先从玻片质量与探针验证入手，再逐项优化严谨性。

09结果判断与质控

P显示预期位置、N低背景且染色体清楚才可评价。正常教学重复序列探针的点数依实际染色体组成决定；本例不凭单个分裂相判异常，须保留逐细胞记录与排除原因。

10实验记录模板

另记日期、操作者、试剂批次、设备型号、原始文件路径、偏离方案及原因；保存所有对照，失败批次也保留。

11常见问题与排错

无信号而DAPI正常

先看P、探针荧光和变性温度；探针或目标未正确变性都可能失败。

背景和晶体多

检查封边、盐、甲酰胺品质和洗液；不把未洗净游离荧光当位置。

染色体模糊/脱落

检查固定、变性过度和洗涤机械损伤；换同批优质玻片再做。

12参考资料

• 旧网络手册物理第111–113页：常规固定染色体变性、甲酰胺杂交与洗涤；纠正原配方不能达到所称50%甲酰胺/10%葡聚糖/2×SSC的问题。
• Vedarethinam等，Metaphase FISH on a Chip: Miniaturized Microfluidic Device for Fluorescence in situ Hybridization，Sensors，2010，PMC3231008，查阅2026-11-02：已读常规玻片对照与Table 2，核对RNase100 μg/mL、甲酰胺变性、10 μL探针、37°C过夜、DAPI和常规对照图；未采用微流控装置、取材或文中混乱的RNase单位。旧法具体洗涤温度仍须本探针阳性验证。