HeLa 划痕入门：24孔板铺多少、怎么洗、同一视野怎么拍

02实验原理

用同一种枪头在连续贴壁单层上制造一条间隙，再回到同一位置测无细胞面积。观察窗口取决于细胞何时形成完整单层、间隙宽度及何时接近完全闭合；先用无处理细胞确定窗口，再进行处理比较。没有0小时图、没有定位信息或间隙已提前闭合的孔，不能补成一条可信时间曲线。

04材料与仪器

• 稳定生长、准入检测合格的HeLa悬液；组织培养处理24孔板，教学先用3个孔。
• 同品牌同规格的无菌200µL枪头，每孔一支；同规格移液器；细胞计数材料。
• 完全培养基、无钙镁D-PBS、无菌吸液耗材；Ⅱ级生物安全柜和37°C/5%CO₂培养箱。
• 倒置显微镜及相机，优先有载物台坐标；10×物镜和足以覆盖间隙两边的成像视野。
• 细尖记号笔只标培养板外底面、图像文件夹和可测面积的ImageJ/Fiji等工具；不在细胞接触面写字。

05配液与用量

1×10⁵个/孔是起始候选，并非保证24小时形成单层。必须显微检查到连续、约95%–100%汇合且无大片脱落后才划痕；若24小时尚不足，继续观察至48小时或下次重新优化起始密度，不在稀疏细胞上硬做。

06时间安排

07开始前的准备

1. 先安排无处理预实验，用3孔测试1×10⁵个细胞/孔能否在24–48小时形成连续单层，以及一条间隙在6、12、24小时是否仍可测量。太早完全闭合时下次提前采图，不事后编造中间点。
2. 培养板外底部为每孔标记3条短定位线，使每条线与预定划痕相交；不要在目标间隙正下方画粗黑线。若显微镜有坐标，记录每孔3个具体x/y位置并保存预览。
3. 预先写质控规则：例如无大片底膜损伤、两侧细胞层连续、目标视野可重复定位，且初始宽度在本次预实验确定范围内。不要看到闭合结果才决定哪些图“画得好”。
4. 每孔准备至少1mL PBS和500µL预温完全培养基。正式采图顺序固定，尽量缩短离箱时间，记录每张实际时间；不同孔0小时也不能全写成同一秒。

08逐步操作

1. 计数后配2mL、2×10⁵活细胞/mL悬液，给3孔各加500µL。前后左右平移培养板让细胞分布均匀，置37°C、5%CO₂培养24小时，不圆周摇动形成中央堆积。
2. 观察每孔至少5个区域，确认连续单层、约95%–100%汇合且无明显空洞或污染。未达到时继续培养并记下实际时间；过密起层或细胞已退化则重新铺板。
3. 划痕前拍一张单层图。将板放柜内，使用同规格无菌200µL枪头，以近垂直姿态轻触孔底，沿预定直线从孔一端平稳划到另一端，一孔一条、一次通过，每孔换枪头。
4. 压力只需移开细胞层；不反复来回刮、不为了修直间隙追加第二刀。若底面出现明显刮伤或大片细胞层掀起，记录该孔失败，不把受损视野当迁移下降。
5. 立即从孔侧吸去含脱落细胞的旧液。沿孔壁缓慢加入500µL PBS，轻柔平移一次后从侧边吸走；再用新的500µL PBS重复一次。每次都不让枪头触及间隙边缘，也不让细胞层风干。
6. 沿壁加入500µL预温完全培养基。盖好培养板，检查是否仍有大量漂浮细胞遮住间隙；若两次洗后仍无法清楚成像，标记异常，不追加猛烈冲洗改变损伤范围。
7. 尽快在10×物镜下找到每孔3个预设视野，保存0小时原图及比例尺。视野必须包括间隙两边，记录孔号、定位标记/坐标、曝光与拍照时间。0小时从换入最终培养液后开始计时，不能用划痕前图代替。
8. 将板回37°C、5%CO₂培养箱；在6、12、24小时按相同顺序回到相同3个位置拍摄。固定物镜、曝光、图像分辨率和分析范围，室温观察时间保持简短且各孔相近，记录实际偏差。
9. 为图像副本生成不含条件的编号，原图只读保留。在同一视野的全部时间点使用相同大小ROI和一致的间隙定义：无细胞区域为面积，不把漂浮碎片误分为贴壁细胞。
10. 以该视野自己的A₀计算闭合率=(A₀−Aₜ)/A₀×100%。先求同一孔3个合格视野平均，再将孔作为技术重复汇总；研究比较需独立培养批次，不能把9个视野当n=9独立实验。
11. 同时记录孔内细胞数量、分裂表现、死亡和边缘脱落。保存分割轮廓与测量表，报告“间隙闭合”；没有独立增殖/死亡控制时，不把百分比写成纯迁移速率。

09结果判断与质控

例如同一视野A₀=0.80mm²、6小时A₆=0.60mm²、12小时A₁₂=0.36mm²、24小时A₂₄=0.08mm²，则对应闭合率25%、55%、90%。面积单位可用像素²，但同一配对图必须比例和ROI一致；要报告mm²须用本物镜的标尺校准。

若12小时已完全闭合，24小时图不能再用于区分该孔更早的闭合速度。出现Aₜ>A₀、闭合率为负时保留原值，检查细胞脱落、毒性、对焦和定位，不把负数强制改成零。本例仅演示基线时间序列，不提供未经测量的预期HeLa闭合率。

10实验记录模板

11常见问题与排错

• 同一孔宽窄不均：固定握法、方向和操作者，在预实验练习；严重不合质控的视野依预设规则标记。不能用窄处0小时配宽处12小时。
• 第二次找不到同一位置：外底标记过少或未记录坐标；本孔时序不可可靠配对，保留缺失记录，不随便选一个相似视野补上。
• 洗后单层大片脱落：孔底被刮伤、冲液太猛或起始状态差；下次沿壁加液并减少压力，不靠补加细胞修复实验孔。
• 差异看似大但对照生长也不同：查增殖、死亡和细胞密度，结合其他终点再判断；仅凭CCK-8正常也不足以排除增殖混杂。

12参考资料

• ATCC：HeLa CCL-2：已核对细胞身份、EMEM+10%FBS、37°C/5%CO₂与安全等级；该页不是划痕验证文献。
• ATCC：Animal Cell Culture Guide：用于培养状态、污染检查和计数原则。
• 本页划痕参数为明确标出的教学预实验起点；尚无本室该株的铺板密度、闭合窗口或纯迁移效应验证数据。