01本篇适用条件
本例只用于已经稳定生长、来源和代次可追溯的ATCC HeLa CCL-2；冻存原料培养条件为EMEM（30-2003）+10%FBS（30-2020），37°C、5%CO₂。ATCC该株冻存建议是完全培养基加5%v/v DMSO，本页不改成其他细胞常见的90%血清+10%DMSO。
采用ATCC通用指南中1–5×10⁶个活细胞/mL范围内的2×10⁶/mL、每管1 mL，作为需要本室复苏验证的教学设置。容器使用可装1 mL样品、符合液氮气相用途的合格冻存管。本例使用经本室验证可实现约−1°C/分钟的4°C预冷降温盒；盒子型号、装填介质及装载要求须在开工前确认。液氮设施操作和转移必须由完成低温培训者进行，不能由网页替代上岗训练。
02实验原理
本次按4支正式库存加约10%分装余量，准备4.4 mL细胞冻存悬液。保护剂配方、活细胞数、控制降温和后续复苏是连在一起的；其中任何一项缺少记录，都不能称为已验证细胞库。先保留同批活培养物，待抽管复苏合格再结束备份。
03安全与适用范围
DMSO会促进皮肤吸收，按SDS防护，避免手套污染。冻存管可能在复温时因残留液氮增压；采用合格气相储存和设施认可取管保护流程。低温转运由受训人员完成，不徒手接触低温器具、不把液氮密闭在无泄压容器中。
04材料与仪器
- 已按传代教程收获的健康单细胞悬液；足量未染色活细胞、完全培养基与无菌细胞培养级DMSO。
- 4支相容冻存管、低温耐久标签和冻存盒库位图；15 mL无菌管、移液器及计数材料。
- 可设置相对离心力×g的离心机；4°C预冷并验证过的受控降温装置、−80°C冰箱、低于−130°C的液氮气相储存设施。
- 低温手套、面屏、护目镜、实验服和封闭鞋；合格转运容器及取放工具。液氮区域需有设施规定的通风与氧浓度监测。
05配液与用量
| 对象 | 组分 | 量 | 结果 |
|---|---|---|---|
| 完全培养基100 mL | EMEM + FBS | 90 mL + 10 mL | 10%FBS |
| 无细胞冻存液10 mL | 上述完全培养基 | 9.50 mL | 加DMSO后总量10 mL |
| 同一冻存液 | 无菌细胞培养级DMSO | 0.50 mL | DMSO终浓度5%v/v；FBS约9.5% |
| 一批4管加余量 | 收获的活细胞 | 8.8×10⁶个 | 重悬后目标4.4 mL |
| 同一批 | 预先混匀的5%DMSO冻存液 | 加至4.4 mL | 2.0×10⁶活细胞/mL |
| 各冻存管 | 上述细胞冻存悬液 | 1.00 mL/管 | 2.0×10⁶个活细胞/管；余0.4 mL不入库 |
假设未冻存悬液活浓度1.1×10⁶/mL，取8.00 mL含8.8×10⁶个活细胞；离心后弃上清，再用冻存液重悬至4.4 mL。若实际浓度不同，用8.8×10⁶÷实测活浓度重新算取液量；不够时减少管数，不通过标签假写到目标值。沉淀残留上清会稀释DMSO，吸液后不留明显液池，也不为追求绝对干燥而吸走沉淀。
06时间安排
| 时间 | 操作 | 判定 |
|---|---|---|
| 前一天 | 核查库位、低温报警、检测记录、预冷降温盒 | 不临时找库位 |
| 当天0–30分钟 | 收获、计数、分配8.8×10⁶活细胞 | 健康单细胞、记录活率 |
| 接着10分钟 | 125×g室温离心10分钟，同时配无细胞冻存液 | DMSO先与培养基混合 |
| 接触DMSO后15–40分钟 | 分4管、核对、在室温完成平衡 | 记录首次接触和入盒时间 |
| 接着至少24小时 | 降温盒置−80°C | 约−1°C/分钟，经本室验证 |
| 随后 | 低温转运入液氮气相，低于−130°C | 核对库位与温度 |
| 长期储存至少24小时后 | 抽1管复苏、检测并保留报告 | 未通过前库存标“待质控” |
07开始前的准备
- 以近期支原体阴性、身份鉴定记录及无菌检查为准入依据。教学起始活率目标≥90%，这是本例预设要求；低于该值先查细胞状态，不靠提高DMSO弥补。
- 为4管生成不同编号，预留同一盒的4个库位；一管计划作质控，也必须有独立编号。标签至少含细胞名、代次、日期、管号，电子表补全来源与操作者。
- 确认降温盒说明要求的介质、装填和预冷已经完成，−80°C有可用位置、液氮气相温度合格。常温离心用的适配器提前配好。
- 从活培养物留一瓶作为备份；检测结果未返回的库存明确标隔离，不能分发为合格库存。
08逐步操作
- 按本系列HeLa传代步骤收获细胞：T75用5 mL PBS清洗、2 mL指定胰酶解离，细胞脱落即加8 mL完全培养基终止。混匀后取独立样本计数和测活率，不使用染色样本冻存。
- 用实测活浓度计算含8.8×10⁶个活细胞的体积，移入无菌离心管。例：1.1×10⁶/mL时取8.00 mL；同时记录收获总体积与取样扣除量。
- 将细胞悬液在室温以125×g离心10分钟，使用相同质量配平管。本参数来自ATCC通用冻存指南；离心机输入×g，不能直接把125误设为rpm。
- 在柜内另一支无细胞管加入9.50 mL完全培养基，再加入0.50 mL无菌细胞培养级DMSO，轻柔混匀。DMSO溶于水会放热，必须先配成均匀冻存液后接触细胞；不要把0.50 mL纯DMSO直接滴到细胞沉淀。
- 离心结束后确认沉淀位置，缓慢吸去上清，枪头不碰沉淀。先加约1 mL已配5%DMSO冻存液，轻柔吹散，再补冻存液至4.4 mL并混匀，记录首次接触DMSO的时间。
- 每分一管前轻柔混匀一次，分别给4支冻存管加入1.00 mL。盖紧至厂家要求，不超装；剩余约0.4 mL按废物流程处理，不另造一支低体积正式库存。
- 按ATCC指南在室温使细胞接触冻存液至少15分钟、最长不超过40分钟，分装时间计在内。本例可预设总计20分钟后入盒；若分装已经花去18分钟，只需再等2分钟，不能额外再等20分钟。
- 将已核对标签的管放入预冷至4°C且验证过的降温盒，立即将整个盒置于−80°C，记录冰箱号和时间。该装置应提供接近−1°C/分钟的降温；不能把裸管直接丢入−80°C替代。
- 至少24小时后由低温受训人员按设施流程转至低于−130°C的液氮气相库位，使用指定工具和转运容器保持低温。不能把−80°C暂存写成长年保存；转运中不在室温台上排管拍照。
- 核对“管—盒—库存表”三者一致并登记转运时间和偏差。液氮气相中再存至少24小时后，抽计划管按复苏教程操作；记录即刻活率、24–72小时贴壁生长和支原体/无菌结果，审核合格后才把余管改为可用库存。
09结果判断与质控
可追溯库存应能准确定位每一管，并有一管复苏后恢复贴壁和生长的记录。教学可预先将复苏即刻活率≥80%、24小时见贴壁、72小时可见增长作为待验证质控目标，不能称为ATCC保证值；低于目标先查因再决定该批用途。冻存当天90%以上活率不能代替复苏后质控。
左为活率、右为贴壁率，四组从左至右为3T3、VERO、HEp-2（右图标作HEp-2C）、BSC-1。原图比较无血清冻存液与含FBS冻存液，不含本篇HeLa，也不是本篇90%FBS加10%DMSO配方的验证；两种终点不可互相替代。仅遮去原图细胞名称前的目录货号，数据、细胞名与图例完整保留。
10实验记录模板
| 批次/细胞/代次 | 身份与支原体记录 | 活浓度/活率 | 取液量/总活数 | 冻存液批号/配方 | 接触DMSO/入盒时间 |
|---|---|---|---|---|---|
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
| 管号 | 分装mL/活细胞数 | 降温盒/−80°C起止 | 转运人/时间 | 液氮罐/架/盒/位 | 复苏质控/状态 |
|---|---|---|---|---|---|
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
| ______ | ______ | ______ | ______ | ______ | ______ |
11常见问题与排错
- 四管细胞数差异大：分装时沉降或团聚；回查每次混匀和计数原始格数，下次缩短等待、逐管轻柔混匀。
- 复苏后几乎不贴壁：依次查冻前状态、误配DMSO浓度、裸管速冻、温度波动及复苏延迟，不能一次随意改多个条件。
- DMSO接触已超过40分钟：标记偏差，不把该批当已按本方案成功制备；保留备份培养物并安排重新冻存和复苏验证。
- 标签脱落或库位不符：将该管设为身份待查，凭同步记录核实；无法确定时不并入正式细胞库，不根据外观猜身份。
12参考资料
- ATCC：HeLa CCL-2，Reagents for cryopreservation：完全培养基加5%DMSO。
- ATCC：Animal Cell Culture Guide，Cryopreservation procedure：125×g 10分钟、1–5×10⁶/mL、1–1.8mL/管、室温15–40分钟、4°C预冷降温盒、至少24小时及低于−130°C储存。
- 本例4管、2×10⁶/mL、1mL/管、20分钟平衡和复苏验收阈值为教学选择，需本室验证。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。