Dojindo CK04 CCK-8：5000细胞铺板、10 µL显色和450 nm计算

02实验原理

正式实验的关键是在加CK04之前，每个检测孔都只有100µL实验培养液；再加入10µL原液，最终110µL。不要先往100µL培养液另加10µL处理液，却仍称为本例100µL体系。每种血清条件有独立无细胞空白，所有孔的CK04量和显色时间一致，同一板3个技术复孔只代表一次独立实验。

04材料与仪器

• 检测合格、稳定生长的HeLa单细胞悬液，三种上表实验培养液；CK04原液，按本批标签储存并避光，频繁使用可按说明0–5°C保存，避免反复冻融。
• 透明96孔板，P20/P200移液器或校准的多道移液器，无菌试剂槽和枪头；计数材料。
• 可读取450nm吸光度的酶标仪、37°C/5%CO₂培养箱、倒置镜、Ⅱ级生物安全柜。
• 下方板图和原始数据文件。外圈孔可加200µL无菌PBS作蒸发缓冲且不参与统计，此为教学布局选择；不采用时也要预先固定边缘孔策略。

05配液与用量

本例各条件有3个有细胞孔和3个无细胞孔，共18孔。两次独立实验请重新培养、重新铺板，不将同一板的3孔记成n=3生物学重复。若换成药物研究，应先另建药物浓度、等量载体和每浓度无细胞干扰方案；本表未提供任何药物IC₅₀方案。

06时间安排

07开始前的准备

1. 先做预实验：每个时间点配一套0、1250、2500、5000、10000个初始接种细胞/孔，各3孔，共45孔，每孔100µL。使用不同孔组读取1、2、3小时，避免反复拿出同一孔造成温度和时间差。48小时前流程与正式实验一致。
2. 预实验要保存接种数与时间的A450曲线，并通过平行培养计数或成像核对48小时实际细胞量。初始接种数不是检测时实际细胞数；若48小时已过密，即使有颜色也不合格。
3. 选择扣空白后信号随细胞量稳定增加、无明显平台且技术重复稳定的区间。教学可预设技术孔CV≤15%作为移液质控起点，但最终线性上限依本机和本细胞验证；不能拿一个通用OD阈值替代预实验。若5000细胞/2小时不符合，先更改方案再正式铺板。
4. 正式板图示例：B2–B4为10%FBS有细胞，B5–B7为10%无细胞；C2–C4和C5–C7分别5%有/无细胞；D2–D4和D5–D7分别1%有/无细胞。B2–D4各孔初始铺100µL细胞液，其余空白孔初始加100µL无细胞10%培养基。正式多板研究需平衡或随机化条件位置。

08逐步操作

1. 依计数教程测未染色悬液活浓度，按目标5×10⁴活细胞/mL配制。例：取浓度1×10⁶/mL原液100µL，加10%FBS完全培养基1900µL，总2mL；轻柔混匀，记录实际活率。
2. 按板图给9个有细胞孔各加100µL悬液，给9个空白孔各加100µL不含细胞的10%FBS培养基。每分装一排轻柔混匀一次，避免细胞沉降；整板前后左右平移混匀，不用圆周摇动聚集细胞。
3. 放入37°C、5%CO₂培养箱24小时。换液前显微查看各组细胞是否均匀贴壁，是否有过密、大片脱落或可疑污染，保存代表性图片。
4. 从孔侧缓慢吸去培养液，不碰底部细胞、不让孔底干燥。B排各目标孔换100µL 10%FBS液，C排各目标孔换100µL 5%FBS液，D排各目标孔换100µL 1%FBS液；有细胞和对应无细胞孔都完成同样换液。
5. 记录处理开始时间，继续37°C、5%CO₂培养24小时。期间不擅自添加额外培养基或改变某组体积；若有蒸发、污染或脱落，拍照并记录，按预设规则处理。
6. 处理结束前设置酶标仪450nm吸光模式，核对板类型、孔位和原始文件保存路径；按说明将CK04工作量取出并避光。本例不自配WST-8粉剂，不用“10倍稀释后的CK04”替代原液。

   

7. 按固定顺序向全部18个孔各加10µL CK04原液，枪头不触细胞层，避免气泡；有细胞及匹配空白同样加。记录首孔、末孔加液时刻，尽量在数分钟内完成，必要时用多道移液器保持时间一致。

   

8. 轻柔水平混匀后置37°C、5%CO₂孵育已验证的2小时。Dojindo说明允许1–4小时，本例不能临时延长到“颜色更深”而使信号饱和。

   

9. 检查气泡，依仪器认可方式排除后在450nm读取，保存未扣背景的全部孔原始吸光度。不要只复制组均值或只导出软件算好的活力百分比。

   

10. 各条件先算对应3个无细胞孔均值，再逐孔扣本条件空白。相对代谢活性=处理组扣背景信号÷10%FBS对照组扣背景均值×100%。先检查复孔离散、分母接近零或负信号，再汇总本次结果。
11. 若要进行研究推断，至少按预先设计重复独立培养批次，先求每批技术孔均值再以批次为统计单位，并配合细胞计数或另一独立终点验证。不要用CCK-8一个读数宣称“血清不足导致细胞凋亡”。

    

    

    

09结果判断与质控

演算例只作算术示范：10%FBS对照A450均值0.860，对应无细胞均值0.110，净信号0.750；某处理组均值0.610，其匹配无细胞均值0.100，净信号0.510。相对代谢活性=0.510/0.750×100%=68.0%。两种空白不同，所以不能一律减同一个0.110。

若扣背景为负、对照净信号接近零、细胞过密或处于预实验平台段，应停止百分比解释并查因。处理后超过100%可能是细胞增殖、单细胞代谢变化或干扰；该数值不等于“存活超过100%”。涉及有色或还原性化合物时必须新增对应无细胞干扰孔，单纯培养基空白不足以排除干扰。

10实验记录模板

11常见问题与排错

• 全部孔颜色很深且差不多：检查是否过密或显色过长，回到密度×时间预实验；不能简单除以对照把饱和数据变成有效结果。
• 复孔差异大：检查铺板前沉降、加液量、细胞被吸掉、气泡与显色时间差。按预设异常规则处理，不能只删除让结果不显著的孔。
• 低血清孔背景不同：分别用对应无细胞血清条件扣除，不能用清水代替实际培养基空白。
• 想加药测试：先补全载体等量、药物终浓度、无细胞药物+CK04干扰孔及处理时长，另做线性确认；本页血清比较不自动构成可解释的药物毒性方案。

12参考资料

• Dojindo：CK04 在线说明书，已阅读General Protocol与Precautions：100µL培养液加10µL、1–4小时、450nm；避免气泡，确定细胞数与显色时间。
• Dojindo：Cell Counting Kit-8 产品资料，已阅读原理、适用范围和干扰说明。
• ATCC：HeLa CCL-2，用于细胞身份、EMEM+10%FBS与培养条件。
• 三档血清比较、5000细胞/孔、24小时处理、2小时显色和CV阈值为教学设置，未声称已在本室获得验证数据。