Caspase-3/7 活性：白板等体积发光法与背景扣除

02实验原理

样本与试剂始终1:1，厂家96孔推荐100µL+100µL。培养基、血清和化合物会影响背景及发光系统，设置无细胞匹配空白、载体细胞和阳性候选。不同细胞量下总RLU不直接可比，应保存原始RLU并用平行可靠活细胞计数或独立蛋白量校正。

04材料与仪器

Promega G8091完整Buffer与冻干Substrate；HeLa、EMEM、FBS；白色96孔培养板；标明浓度的1mM星形孢菌素/DMSO母液；计数材料、板振荡器、可读化学发光的酶标仪。CCK-8的450nm吸光模式不能替代发光模式。

05配液与用量

12孔示例：载体有细胞3孔、阳性有细胞3孔、载体无细胞3孔、阳性无细胞3孔。每种处理独立空白，不能仅用纯水作背景。

06时间安排

07开始前的准备

先用2500、5000、10000细胞/孔和加试剂后30、60、120分钟建立信号与细胞量、反应时长的可用区间。1µM星形孢菌素4小时是阳性候选，不能保证最佳caspase峰值，应检查形态与独立凋亡终点。正式样本优先选尚未大量崩解的窗口；更强死亡可能反而减少可检测酶活。

08逐步操作

1. 计数并配5×10⁴活细胞/mL悬液，每个有细胞孔加100µL，即5000活细胞；无细胞孔加100µL同批培养基。
2. 37°C、5%CO₂培养约24小时，检查贴壁和分布，另铺相同条件平行板供活细胞量记录。
3. 去旧液后每孔换入100µL上表阳性或载体培养液，无细胞空白同步更换对应配方，处理体积一致。
4. 37°C、5%CO₂处理4小时，记录实际起止和形态。处理结束后不倒掉含漂浮细胞的上清，也不PBS洗掉凋亡细胞。
5. 依G8091规格将Buffer与Substrate分别回室温，将整瓶10mL Buffer加入整瓶Substrate，轻旋或倒转至充分溶解。
6. 将培养板取出，在室温平衡约30分钟；各板不要高叠导致温度不均。试剂同样保持室温，不把冷试剂直接加到热板。
7. 以固定顺序向每孔现有100µL样本加入100µL反应液，避免气泡；无细胞孔也加同量，最终每孔200µL。
8. 用相容板振荡器300–500rpm轻混30秒，避免飞溅到相邻孔，随后盖板室温避光放置1小时。

   

   

   

9. 选择发光模式、固定积分时间（教学候选1秒/孔，需在本机确认），不设450nm吸光波长，检查高值未超仪器范围。
10. 读取并保存全部原始RLU，分别扣除本处理无细胞空白均值；原值、空白和净值均保留。

    

11. 平行板记录对应活细胞数，净RLU除以该数得到单位活细胞量指标；若用蛋白量校正，先证明裂解/试剂体系兼容，不直接在同一发光混合液中套BCA。
12. 计算相对载体倍数并同时报告原始净信号、细胞量及独立批次；结合Annexin/形态复核，不仅凭RLU升高宣称发生某一死亡机制。

    

    

09结果判断与质控

例如匹配空白2000RLU，载体22000、阳性102000，净值分别20000和100000，未校正总活性为5倍。若对应活细胞数4000和2000，单位活细胞净值5与50，则为10倍；两者含义不同，应并列说明。对照净值接近零时不报告失真的巨大倍数。

10实验记录模板

11常见问题与排错

全部发光低：查试剂是否正确复溶、发光模式、反应温度及控制是否处峰值。背景高：查血清背景、处理物自身干扰和空白配方。死亡越强信号越低：可能酶失活或细胞丢失，应重做时程与独立终点，而非直接判无凋亡。

12参考资料

• Promega：Caspase-Glo 3/7官方技术手册TB323，已读取G8091整瓶10mL复溶、100+100µL、300–500rpm30秒及室温30分钟至3小时窗口。
• ATCC：HeLa CCL-2。5000细胞、阳性候选、室温平衡约30分钟、1小时反应与1秒积分为本页待验证教学设置。