新手带教｜贴壁细胞 TRIzol 提取总 RNA

02实验原理

胍盐和酚使细胞迅速裂解并抑制核酸酶；氯仿后离心分为水相、界面和有机相，RNA主要位于上层水相。异丙醇让RNA沉淀，75%乙醇洗盐，RNase-free水重溶。最关键的手上动作是取水相时不碰界面、工作区RNase-free、严禁含胍废物接触漂白剂。

04材料与仪器

• 普通贴壁细胞、TRIzol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase-free水；不在加裂解剂前PBS冲洗。
• RNase-free管和枪头、P100/P200/P1000、细胞培养皿、耐有机溶剂离心管。
• 可在4°C达12,000×g的微量离心机、化学通风橱、55°C热块、冰盒、计时器；适当的RNA定量与完整性检测设备。
• 独立、已清洁的RNA工作区；标记含苯酚、氯仿、异丙醇与胍的独立废液容器。

05配液与用量

配10 mL 75%乙醇：7.5 mL无水乙醇，以RNase-free水补至10 mL。体积以最终刻度为准。

06时间安排

07开始前的准备

先把通风橱内外的物品分区：外部放冰盒、干净枪头和RNA-free管；橱内只放当前有机试剂和废液。离心管确认耐苯酚/氯仿并适配转子；对称配平至制造商要求。细胞处理结束后立即裂解，或按已验证的快速冻存方案冻存。切勿在RNA样本旁使用RNA酶、普通手套触摸管口或共用有污染的移液器。

08逐步操作

1. 换新手套，清洁专用工作区并标记S1等样本管、TRIzol废液和有机废液容器；检查离心机已预冷4°C。

   

2. 记录细胞系、培养皿大小、融合度、处理条件、收样时间及估计细胞数。
3. 从培养箱取皿后吸尽培养液。不先PBS洗涤，避免增加操作时间和RNA降解风险。
4. 在皿内直接加入1 mL TRIzol，立即覆盖整个生长面；P1000缓慢吸打数次使细胞裂解匀浆。
5. 将匀浆转移到耐有机试剂管；沿皿面冲洗残留裂解液并合并，盖紧。
6. 室温放置5分钟，使核蛋白复合物充分解离；开始时记录计时，不要跳过。
7. 每管加入200 μL氯仿，立即盖紧；在化学通风橱中用手剧烈振荡约15秒，直至均匀乳浊。
8. 室温放置2–3分钟，过程中不反复开盖闻味或振荡。
9. 4°C、12,000×g离心15分钟。确认输入栏是×g；如果仪器只有rpm，需要按转子半径换算，不能照抄其他离心机的rpm。
10. 取出后可见上层无色/淡色水相、中间界面和下层有机相。保持管垂直，估计水相体积约400–500 μL。
11. 用P200或适配枪头沿管壁慢慢转移上层水相到新RNase-free管，界面上方留约2–3 mm液层不取。宁少勿带界面。

    

    

12. 加入500 μL异丙醇（按最初1 mL TRIzol计），轻柔颠倒混匀10次，盖紧室温静置10分钟。

    

13. 4°C、12,000×g离心10分钟。开盖前标记铰链方向以便定位可能不可见的RNA沉淀。
14. 缓慢吸走上清，不让枪头触及沉淀区域；如果不确定沉淀在哪一侧，先少吸一部分再旋转管观察。
15. 沿与沉淀相反的内壁加入1 mL 75%乙醇，轻轻颠倒洗涤；4°C、7,500×g离心5分钟。
16. 吸去乙醇，短暂再离心使残液汇集管底，用P20小心移走最后液滴；避免直接戳沉淀。
17. 开盖室温风干5–10分钟，看到无明显乙醇液滴即可。不要风干至硬透明薄膜，过干会很难溶解。
18. 加30 μL RNase-free水，盖好并在55°C加热10分钟；轻弹/缓慢吹吸帮助溶解，不要剧烈涡旋。
19. 取少量测RNA浓度和纯度，另取等量样本跑变性胶或使用适合RNA的完整性分析平台。定量前轻混并短暂离心。
20. 记录浓度、总量、A260/280、A260/230及完整性；做表达分析前用匹配DNase方案处理并保留NoRT。分装保存于经验证的−80°C条件，避免反复冻融。

09结果判断与质控

良好样本应能重溶，Qubit RNA HS给出高于定量下限且重复性合理的浓度；RNA电泳可见与物种/样本一致的主要核糖体RNA信号。概念示意图会展示“完整、降解、酚污染时”的外观趋势，不模拟真实峰值/RIN。A260/280约2.0只是常见参考，A260/230偏低可见于盐、胍、酚等残留；不能仅凭一个比值宣布合格。

10实验记录模板

11常见问题与排错

RNA浓度低

核对细胞数量、裂解覆盖、是否丢失沉淀、空白与移液器；起始少于1×10⁶细胞或少于10 mg组织时，原厂允许在水相中加5–10 μg RNase-free糖原（glycogen）辅助沉淀；本例约10⁶细胞不默认需要。糖原不是载体RNA，不能用外源RNA替代，否则会影响定量及RT输入。

A260/230低或RT/qPCR受抑

考虑水相带入界面/苯酚、胍或洗液残留。用适合RNA的cleanup/DNase体系处理，再重新定量，不要靠多加逆转录酶补偿污染。

样品快速降解

排查RNA酶污染、收样至裂解延迟、管口/枪头污染和冻融；先用阳性RNA参考品确认分析仪器。

RNA有DNA信号

TRIzol本身不保证完全除DNA。按下游目的做DNase及纯化，并设置NoRT对照。

12参考资料

• Thermo Fisher, *TRIzol Reagent User Guide*, Rev D, physical pp.1–2。本文采用官方相分离与沉淀比例，步骤解释及QA为原创编辑。
• 本站原创流程和RNA质量概念图；不将图作为实测RNA或RIN。参数边界与SDS提示见 beginner-source-review.md。