新手带教｜总 RNA 逆转录制备 cDNA（含 No-RT）

02实验原理

逆转录酶以RNA为模板合成互补DNA。RT组含酶；No-RT不含酶但保留同量RNA，用于识别基因组DNA或扩增产物污染。之后qPCR的NTC则没有模板，用于检查反应配制污染；两种阴性对照不能互相替代。

04材料与仪器

• RNA样本、10×RT buffer、25×dNTP mix、10×random primers、MultiScribe reverse transcriptase、RNase inhibitor、无核酸酶水。
• RNase-free PCR管/板、低吸附管、P10/P20/P200、封板膜、冰盒。
• 可编程PCR仪/热循环仪，能运行25°C/37°C/85°C并有适配20 μL管的热盖设置；微量离心机。
• RNA定量记录、NoRT标签及无核酸酶操作区。

05配液与用量

每个20 μL反应：10×buffer 2.0 μL、25×dNTP 0.8 μL、10×random primers 2.0 μL、逆转录酶(50 U/μL)1.0 μL、RNase inhibitor 1.0 μL、水3.2 μL、RNA 10 μL（50 ng/μL，共500 ng）。

1.5倍预留可降低微量损失。若多样本分批，分别按RT+、NoRT母液计算；酶最后加入RT+母液并置冰上。

06时间安排

07开始前的准备

以RNA 50 ng/μL为本例：每管10 μL提供500 ng。若浓度不是50 ng/μL，先算RNA体积V=500/浓度（ng/μL）。仅当V≤10 μL时才加水至10 μL；若V>10 μL，需先用经验证的RNA浓缩方法处理并重新定量，或在厂家允许范围内为所有比较样本统一降低RNA输入质量。不要直接增加RNA体积挤掉buffer或扩大20 μL体系，NoRT保持相同输入。给样本RT+/NoRT配对编号。打开酶前先完成非酶组分和管位图。

08逐步操作

1. 取出RNA与试剂按说明在冰上融化；RNA避免长时间室温放置，dNTP和引物完全融化后轻混。
2. 记录每份RNA的浓度、输入体积和总质量。核对每个RT+及NoRT输入同一份RNA、同为500 ng。
3. 给每样本准备RT+和NoRT两管，写清样本编号、酶+/−及后续稀释编号，先做管位图。
4. 在冰上按多反应量+50%余量配RT+无模板混合液：buffer、dNTP、random primers、RNase inhibitor、水依次加入。
5. 轻柔吹打或涡旋短混非酶组分，再短暂离心收液。避免把dNTP或RNA留在管壁。
6. 将NoRT mix另配一管：与RT+完全相同，但用水补上省去的逆转录酶体积。
7. 最后向RT+母液加入逆转录酶，轻柔混匀；不要把酶加进NoRT母液，两种母液分开放置。

   

8. 每管分装10 μL对应master mix，RT+与NoRT使用独立枪头或先分NoRT后分RT+，减少酶交叉污染。
9. 每管加10 μL该样本RNA，轻轻吹吸2次混匀；NoRT加入完全相同RNA体积。
10. 每管轻弹混匀并短暂离心，把液体收至管底，检查无气泡和挂壁。
11. 盖紧管盖/封板，确认热循环仪适配管型；设定总体积20 μL，启用与试管/封膜匹配的heated lid选项。
12. 编程25°C 10分钟、37°C 120分钟、85°C 5分钟、4°C保持。热盖温度按设备厂商设置，不自行规定统一温度。

    

13. 把板/管放入仪器并核对方向、样本位置与屏幕程序；运行中不打开管盖。
14. 程序完成后取出样本，短暂离心；记录运行程序文件、仪器编号、开始和结束时间。
15. 按1:5做教学稀释：20 μL RT产物+80 μL无核酸酶水，总体积100 μL。若产量不足则按同一比例缩小并注明实际量。
16. 同样稀释NoRT，但保持RT+和NoRT管的稀释倍率一致；标签注明“cDNA等效液”，而非RNA或纯cDNA浓度。

    

17. qPCR每反应若加2 μL该稀释液，约相当于10 ng起始RNA；每个目标都同时测RT+、NoRT和NTC。
18. 将产物分装，短期4°C只按验证时限保存，长期按酶/实验室已验证的低温条件保存；避免反复冻融。
19. 不用NanoDrop测RT mix来宣称cDNA产量；盐、引物和dNTP会干扰吸收。后续用qPCR对照评估可扩增性。
20. 检查记录：RT+/NoRT配对、加酶情况、最终体积、程序、稀释倍率、冻融次数及偏离，并把所有产物清楚标识。

09结果判断与质控

RT+应在合适的目标基因上出现可重复扩增；NoRT通常应无扩增或显著晚于RT+，其判定阈值需项目预先规定。没有RNA模板的NTC在qPCR阶段另设。示意图展示RT+和NoRT的关系，不代表实验实际Cq。短片段单独能扩增也不证明所有转录本完整。

10实验记录模板

11常见问题与排错

RT+没有扩增

查RNA是否严重降解/带酚胍、酶是否冻融失活、程序/体积是否正确、引物与靶标是否匹配；设置阳性参考RNA。

NoRT有扩增

检查基因组DNA污染、引物是否能扩增基因组序列以及前PCR污染。考虑DNase/跨内含子引物并保留原始NoRT结果。

不同样本差异巨大

核对RNA实际输入量、浓度单位、移液和稀释倍数；不要通过手工调Cq阈值“拉齐”。

液滴在盖子上

确认封板、离心收液、管型与热盖设置；必要时按仪器说明做短暂离心后重跑。

12参考资料

• Applied Biosystems, *High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol*, physical pp.18–20；本文只采用含RNase inhibitor的20 μL配方和热程序。
• 本站原创NoRT配对图解；图中如出现演示曲线会明确标“教学模拟，非实验数据”。