新手带教｜ABI 7500 两步法 SYBR qPCR 上板与设置

02实验原理

SYBR染料与双链DNA结合，因此既会报告特异扩增产物，也会报告非特异产物/引物二聚体。实时扩增曲线用于Cq判读，熔解曲线检查产物热稳定性特征；单峰只是必要线索之一，不能单独证明序列正确。NTC看配液污染/二聚体，NoRT看基因组DNA，两者都要。

04材料与仪器

• Power SYBR 2×master mix、经验证的正反引物10 μM、无核酸酶水、稀释cDNA、NoRT、NTC水。
• 光学96孔反应板、配套透明光学封膜、板离心机、冰盒、P10/P20与滤芯枪头。
• ABI 7500实时PCR仪，选择Standard而非Fast模式；SYBR Green reporter；试剂自带ROX体系按软件选择ROX passive reference；不另加ROX。
• 有效SYBR校准/染料设置、引物验证记录、孔位图、阳性参考模板和无模板对照。

05配液与用量

每孔20 μL：2×Power SYBR Mix 10 μL、正向10 μM引物0.6 μL、反向10 μM 0.6 μL、无核酸酶水6.8 μL、模板2 μL；引物终浓度各300 nM。NTC将2 μL模板替换成2 μL水，NoRT替换为对应NoRT稀释液。

本例按17份配母液，每条引物实际一次加入10.2 μL，无需逐孔移0.6 μL。若必须配单孔而0.6 μL移液不准，可将10 μM引物以1:2稀释为5 μM工作液（例如20 μL引物+20 μL水）：正反各1.2 μL，水改为5.6 μL，2×Mix仍10 μL、模板仍2 μL，总体积20 μL、引物各300 nM。勿把较稀引物代入原10 μM配方。

06时间安排

07开始前的准备

先对照引物记录确认基因、物种、扩增子长度、方向和效率。不要只拿教程里的例子代替已验证引物。规划孔位，尽量使条件在板上分布均衡、避免只占板角；NTC三孔和NoRT三孔分开安排。准备同批cDNA、NoRT、阳性参考品，所有模板在冰上解冻并轻混。

08逐步操作

1. 核对ABI7500模块、熔解曲线功能、SYBR通道校准状态、标准96孔光学耗材和Standard run mode。
2. 为每孔编号，先写清A RT+、A NoRT、B RT+、B NoRT、NTC的孔位；每条件三个技术复孔。

   

   

3. 检查引物工作液浓度均为10 μM、冻融次数和序列记录；不同目标基因分开准备master mix。
4. 冰上融化2×SYBR Mix，避光保存并轻柔混匀；短暂离心收集液体。
5. 计算每个目标15孔，另加2孔移液余量，按17孔计算所有无模板组分。
6. 每目标配306 μL mix：170 μL 2×Mix+10.2 μL Forward+10.2 μL Reverse+115.6 μL水；每次加入后更换枪头。
7. 轻柔混匀、短暂离心。避开剧烈涡旋导致气泡，放冰上等待。
8. 每孔加18 μL相应引物mix，分装时枪头贴孔壁、移液速度慢，避免枪头碰邻孔液滴。

   

9. 单独加入2 μL对应RT+、NoRT或水；NTC最后加水或用单独区域操作，减少阳性模板污染。
10. 每条件三复孔使用同一模板母液；模板加完后轻轻敲板或板振荡器短混，不让液体溅到封膜区域。
11. 贴紧光学膜，用板离心机短暂离心收集所有液体并去气泡；避免高温导致边缘蒸发。
12. 软件中新建SYBR实验，选择96孔板、20 μL反应体积、Standard模式；Reporter选择SYBR，Passive Reference按Power SYBR体系设ROX。
13. 设置95°C 10分钟预变性/酶激活，40个循环：95°C 15秒、60°C 1分钟，并在60°C步骤采荧光。
14. 加熔解/解离曲线阶段，使用ABI软件或本机Power SYBR程序推荐的升温范围、斜率及读数设置；保存并记录实际Ramp，不臆造统一升温速率。

    

15. 选择对应孔位的目标名、样本名和重复编号；检查NTC/NoRT标识，不把软件自动命名留作最终记录。
16. 上机前查看板膜平整、无气泡、无漏加孔；在软件中再次核对板型、体积、SYBR/ROX和程序并截图存档。
17. 运行并观察扩增过程中是否有异常温度/信号错误；若中途报错，保存运行文件和日志后判断是否需整板重跑。
18. 运行后先看扩增曲线是否呈S形、基线期合理、三复孔一致；在所有样本间使用统一分析设置。
19. 再看熔解曲线：目标样本应出现主要单峰，NTC不应出现与目标相同的明显产物峰；查看NoRT是否有放大。
20. 保存原始EDS/仪器文件、导出表、板图、阈值/基线设置、熔解曲线和异常记录；按pre-PCR区域规程处置封板。

09结果判断与质控

教学模拟扩增图中有效模板出现可重复S形，NTC不出目标峰，NoRT明显晚于RT+或未检出；熔解曲线显示一个主峰。Cq40处的Undetermined按缺失处理，不用40代入ΔCq。三个技术复孔只反映移液/检测重复性，不是n=3独立实验。出现多峰、拖尾、NTC峰或引物效率未知时，先优化再做表达结论。

10实验记录模板

11常见问题与排错

NTC有早期扩增

停止解释表达量，检查配液区扩增子污染、引物特异性和样本枪头交叉；清洁并重配，不能只删NTC孔。

熔解曲线多峰

检查引物、退火温度和模板输入；跑胶或测序确认目标条带。优化引物浓度/温度须预先设计并整批一致。

三复孔Cq差异大

检查气泡、加样体积、混匀、封膜、板边蒸发和低拷贝随机性；不要只删离群孔，先按预设规则判断。

所有Cq都靠后

核对RNA输入等效量、逆转录、引物效率、抑制物、通道设置与体系兼容性；用阳性参考品定位问题。

12参考资料

• Applied Biosystems, *Power SYBR Green PCR Master Mix User Guide*：前轮取得的官方46页PDF，物理pp.10、24–25、28–30；该体系含ROX且允许标准模式。
• 本站原创板图与模拟曲线，图内/图注标“教学模拟，非实验数据”。不声称所有ABI固件页面相同；版本差异按本机手册记录。