01本篇适用条件
本篇用固定细胞DNA含量评估细胞周期，适合普通已建立非感染性贴壁细胞，染料指定为即用型FxCycle PI/RNase staining solution。建议未处理对照和至少3份独立培养重复。不能把即用染液体积套给自配PI/RNase；细胞聚团、核糖核酸残留、固定不完全和双联体都会改变直方图。此读数不能区分G0与G1，也不能区分G2与有丝分裂期。
02实验原理
PI结合核酸后荧光强度近似反映DNA量。RNase处理用于减少RNA带来的额外染色。单细胞通常在G0/G1形成2C峰、S期形成连续分布，G2/M形成约双倍荧光峰。DNA含量须用线性放大；先以面积-高度/宽度关系排除双联体，否则两个2C细胞可能伪装成一个4C事件。
03安全与适用范围
PI按核酸染料及机构规定防护和收集。乙醇易燃，远离明火；固定细胞不代表可以任意排放或取消生物安全规程。流式采集需经过平台培训，离心管对称配平。固定剂及废液按各自SDS处置。
04材料与仪器
- 普通贴壁细胞、冷PBS、无水乙醇、即用FxCycle PI/RNase staining solution。
- 15 mL管、流式管、P1000/P200、细胞刮刀或温和解离用品、细胞计数设备。
- 可用488或532 nm激发、PI等效约585/42发射检测的流式仪；需DNA信号线性放大、脉冲面积+高度或宽度参数、事件时间图。
- 经验证的转子、低速采集设置、仪器当天QC。参数不能替代本机SOP。
05配液与用量
| 项目 | 教学起始量 | 说明 |
|---|---|---|
| 每份细胞 | 约1×10⁶个 | 样本间细胞数尽量一致 |
| 70%乙醇固定液 | 300 μL PBS+700 μL无水乙醇 | 滴加到细胞中，最终约70% v/v |
| 固定后洗涤 | 每次约1 mL PBS | 至少两次起步，直到无明显乙醇气味/液体；以平台SOP为准 |
| 即用PI/RNase染液 | 每1×10⁶固定细胞500 μL | 不稀释、不在染色后洗涤 |
| 染色 | 室温避光30分钟 | 指定体系允许15–30分钟 |
乙醇加入PBS细胞悬液而非反向把细胞直接倒入大量酒精，以降低结团风险。若不同固定体系，不能直接照搬本表。
06时间安排
| 阶段 | 条件 | 用时 |
|---|---|---|
| 收样和计数 | 温和消化 | 20–35分钟 |
| 逐滴固定 | 预冷乙醇，混匀 | 10分钟 |
| 固定 | −20°C | 至少2小时；可以按验证流程延长 |
| PBS洗涤/重悬 | 约300×g、5分钟作为起点 | 20分钟 |
| PI/RNase染色 | 室温避光 | 30分钟 |
| 流式采集和检查 | 低流速起步 | 30–60分钟 |
07开始前的准备
每组独立培养重复单独制备。每管约1×10⁶个细胞，管壁标记组别和固定时间。用绝对乙醇和PBS配最终70%乙醇，预冷至−20°C附近。先建立单细胞门和DNA-A/DNA-H参数，选择线性放大；荧光增益先让主要G1峰在显示范围约前1/3至中段，保证G2峰不溢出。这是显示范围的调节原则，不是固定电压。
| 仪器/参数 | 本例设置 | 如何调整与核对 |
|---|---|---|
| 冷离心机 | 300×g、4°C、5分钟起点 | 固定细胞可能更脆弱，以本机SOP校验 |
| 激发/检测 | 488或532 nm；585/42或等效PI通道 | 确认实际配置，固定细胞不混用凋亡染色流程 |
| DNA放大 | Linear线性，DNA-A | 不采用对数DNA轴做相位面积积分 |
| 增益 | 参考G1峰在量程前1/3到中段 | G2约双倍荧光不饱和；整批固定设置 |
| 单细胞门 | DNA-A对DNA-H/W，结合FSC | 排除双联体后再做周期；记录门 |
| 采集 | 流体聚焦仪先低流速，目标20,000单细胞 | 观察时间图；不同设备按平台已验证流速 |
08逐步操作
- 记录样本名称、独立培养编号和处理结束时刻；准备一管未处理基线对照，不要把技术重复当生物学重复。
- 标记流式管，预冷PBS和乙醇；离心机使用经验证的低速条件，配平管质量。
- 从培养皿收集贴壁细胞，用温和解离条件避免长时间胰酶处理；记录融合度和细胞状态。
- 约300×g、5分钟收集细胞，吸上清时留一点液面防止吸走松散沉淀。
- PBS轻柔重悬、再收集一次以清除血清。取少量计数，分装每组约1×10⁶细胞。
- 每管加入约300 μL PBS重悬，充分打散但不猛烈涡旋。结团会在固定后难以消除。
- 一边缓慢轻混，一边沿管壁逐滴加入700 μL预冷无水乙醇；不要一次倒入或把细胞加到乙醇底部。
原创教学图解：PI/RNase细胞周期固定至染色的教学流程。
本站原创绘制，参数依照文中限定体系；非原始文献截图。本站原创教学图解。允许随本方法页学习使用；不得误标为实测数据。点击图片查看原图 ↗ - 盖紧，混匀后放−20°C至少2小时。记录固定起止时间；同一比较实验各组固定时长一致。
- 固定后低速离心约300×g、5分钟收集细胞，缓慢吸去乙醇上清。
- 加约1 mL PBS温柔重悬、离心洗涤；重复一次。若上清仍明显含乙醇，可按本平台规范追加洗涤。
- 最后用PBS重悬，轻轻通过细口枪头或过滤帽去除可见团块。不要丢弃大块团聚物后不记录，因为选择性损失会改变比例。
- 再次计数或按固定输入量分装。把样本浓度调整到各管相近，减少细胞数差异对采集的影响。
- 离心形成细胞沉淀，吸净PBS；每约1×10⁶细胞加入500 μL即用PI/RNase染液。
- 轻柔混匀，室温避光染30分钟。染后不洗，不要再加入第二种DNA染料混淆信号。
- 在仪器中选488/532 nm兼容激发和585/42或等效滤片，信号选线性DNA通道。先用稳定参考样本调整，使G1不贴边且G2峰仍在量程内。
- 低速采集起步，显示DNA-A对DNA-H（或DNA-W）关系，圈定双联体排除区；另看FSC/SSC完整细胞、事件时间稳定性。
原创教学图解：单细胞与双细胞聚集体如何影响DNA含量直方图。
本站原创绘制，参数依照文中限定体系；非原始文献截图。本站原创教学图解。允许随本方法页学习使用；不得误标为实测数据。点击图片查看原图 ↗ - 用单细胞DNA-A直方图确认主要峰清楚，再采各样本。每样本以约20,000个门内单细胞为教学目标，必要时按精度要求增加。
- 统一单细胞门后，在平台验证的细胞周期软件中选择合适的DNA分布拟合模型（例如Watson或Dean–Jett–Fox），检查拟合与原始直方图的叠加和残差。记录模型、拟合质量、G0/G1、S、G2/M比例及排除事件；不要仅用手画三段矩形门替代重叠相位拟合。
- 每个独立培养重复分别导出直方图、峰位、相位比例、FCS、仪器设置及门控版本，再对生物学重复汇总。
- 按平台规程清洗流路并处理PI/乙醇废液；记录本次样本聚团、采集速率和任何偏离。
09结果判断与质控
示意数据为20,000个合格单细胞：G0/G1 11,000（55%）、S 6,000（30%）、G2/M 3,000（15%）。示意直方图中G1与G2位于任意线性通道50和100，不是仪器固定值。图和图注均标“教学模拟，非实验数据”。细胞系可能有非整倍体，故使用相对主峰而不宣称正常二倍体核型。
原创教学图解：55%/30%/15%混合分布的概念教学图。通道为任意值；教学模拟，非实验数据。
10实验记录模板
| 组别/生物学重复 | 细胞数 | 固定液比例/温度/时长 | 洗涤次数 | PI染液量/时间 | 激光/滤片 | DNA放大 | 门内单细胞数 | G1/S/G2-M % |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 待填 | 1×10⁶目标 | 70%/−20°C/≥2h | 待填 | 500 μL/30 min | 待填 | linear | 目标20,000 | 待填 |
11常见问题与排错
直方图峰很宽
先看乙醇是否逐滴加入、固定前团块、固定时间差异、染色混匀、流速和双联体排除，再确认仪器QC。
G2峰荧光恰为G1两倍但比例异常
确认单细胞A/H门、峰是否重叠/饱和、细胞是否同步处理。不能靠挪相位边界把比例调成预期。
G2峰超出范围
降低荧光增益或调整检测范围，重新用参考样本采集整批；保存新的仪器设置并保持比较样本一致。
大量亚G1事件
可能有凋亡、碎片、固定问题或细胞破损。使用独立凋亡检测和显微检查验证，勿把亚G1直接报告为凋亡百分率。
12参考资料
- Thermo Fisher, *FxCycle PI/RNase Staining Solution User Guide*, physical pp.3–4；即用染液、线性DNA信号、染后不洗及585/42等效检测。
- 本站原创图解；模拟直方图注明“教学模拟，非实验数据”。完整参数边界见
beginner-source-review.md。
做完最后一步，再核对原始记录。填写实际用量、起止时间与观察结果；遇到异常，先记录，再查看排错说明。