新手带教｜Annexin V/PI 流式检测细胞凋亡

02实验原理

Annexin V在有钙条件下结合外翻的磷脂酰丝氨酸；PI进入膜完整性受损的细胞并结合核酸。两种荧光联合可以初步分出活细胞、早期凋亡样、双阳性和PI单阳性群体。流式仪器的光路和电压决定群体位置，没有跨所有型号通用的PMT电压；当天用单染对照设检测范围与补偿。

04材料与仪器

• 对照与处理细胞、PBS、1×Annexin结合液（体系中含钙）、Alexa Fluor 488 Annexin V、1 mg/mL PI储液；不要用EDTA洗脱或普通无钙PBS配染色液。
• 流式管、低吸附管、细胞刮刀或温和解离液、计数板/细胞计数仪、P20/P200/P1000。
• 可检测488 nm激发的流式仪（绿光约530 nm、PI约575 nm或本机等效通道）、单染和未染对照；具体滤片与激光先向平台确认。
• 防光管架、冰盒、经验证的阳性对照样本。诱导处理条件由本实验室已验证方案提供。

05配液与用量

以下沿用Annexin V Alexa Fluor 488/PI的具体体系，不可将体积照搬至FITC-Annexin、其他PI浓度或无钙buffer。

预留枪头吸附与移液损失；先配master mix只适用于等体积样本，单染管按各自染料设置。

06时间安排

07开始前的准备

建议每条件至少准备独立生物学重复；一个样本的技术重复管不能替代独立培养。每管最终按约1×10⁵细胞准备100 μL染色输入。先在流式软件建样本模板：FSC/SSC、单细胞门、Annexin绿通道、PI通道、采集时间图。确认仪器当天QC通过、液流稳定、废液足够。染色时不固定；取样前保留培养上清中的漂浮细胞。

08逐步操作

1. 先在记录本画出管名：未染、Annexin单染、PI单染、阴性、处理组和阳性对照；给每管预留条码/编号。
2. 检查培养皿并记录处理时间。若处理组已有漂浮细胞，连同培养上清一起转入标记管，不可只消化仍贴壁的细胞。

   

3. 温和冲洗培养皿一次，将冲洗液并入漂浮细胞管；再温和解离剩余贴壁细胞并合并。不同处理条件分开操作，防止交叉。
4. 约300×g、5分钟收集细胞作为起始设置；不同转子/细胞需按平台SOP校正。吸上清时枪头远离细胞沉淀。
5. 用冷PBS轻柔重悬、再离心洗一次以除培养基血清；不要使用含EDTA的胰酶残液或含钙螯合物。
6. 用少量PBS温和重悬并取样计数，记录细胞浓度、活率和总回收量。若破碎很多或结团严重，先查处理/解离条件。
7. 按细胞数为每个染色管取约1×10⁵个细胞，再以约300×g、5分钟收集。未染管也走相同洗涤流程。
8. 按1份5×结合液加4份纯水配制1×液，混匀并标记配制时间；它是染色体系，不要误用普通PBS替代。
9. 从1 mg/mL PI储液取5 μL加入45 μL 1×结合液，配成100 μg/mL工作液；避光，按说明管理剩余液。
10. 将各管细胞沉淀分别重悬于100 μL 1×结合液。若沉淀黏壁，沿壁冲洗并用宽口枪头轻柔混匀。
11. 未染管不加染料；Annexin单染管只加5 μL Annexin；PI单染管只加1 μL PI工作液；双染样本各加5 μL Annexin和1 μL PI。

    

12. 轻轻混匀，不涡旋；室温避光计时15分钟。各管起止时间一致，不能把配完第一管到上机的延迟忽略。
13. 每管加入400 μL 1×结合液，轻混并置冰上短暂等待。染好后尽快采集，不要隔夜保存或染后洗涤。
14. 检查仪器状态并上未染对照。调整FSC/SSC让完整细胞落在显示范围，避免碎片主群或FSC/SSC过曝；保存电压与仪器配置。
15. 用单染管查看各荧光通道：阴性群体应在低端，阳性群体应可分辨且不贴边饱和。检查串色后用仪器补偿向导计算Annexin和PI间补偿。
16. 固定通道电压与补偿后采阴性、阳性及处理样本；各管用同一门。以低流速为起点，目标采集约20,000个合格单细胞事件，并观察事件-时间图有无堵塞/漂移。
17. 依次画FSC-A/SSC-A主细胞门，再画FSC-A/FSC-H或A/W单细胞门，最后看Annexin绿光与PI散点图。排除碎片和双联体，但不要排除PI阳性细胞。

    

18. 依据未染和单染确定象限，不以处理组“看起来更符合预期”为依据。导出每象限计数、百分比、补偿矩阵、通道电压、采集事件数和FCS原始文件。
19. 计算Annexin阳性比例=(Annexin+/PI− + Annexin+/PI+)/所有合格单细胞×100%。独立重复分别计算，后续统计以生物学重复为单位。
20. 采集完成后按平台要求冲洗流路、关机或待机、清理工作台，并记录异常气泡、堵塞、样本延迟和任何门控更改。

09结果判断与质控

预期为未染低荧光、单染各有可分离阳性群；阴性对照大部分双阴性。示例教学图显示20,000个单细胞：15,000双阴性、3,000 Annexin+/PI−、1,600双阳性、400 PI单阳性；Annexin阳性=(3000+1600)/20000=23%。该数值是教学模拟，不能当作细胞系的“正常范围”。如阴性本身双阳性很多，先排查收样损伤、消化过度、处理时间和延迟；不要为了得到漂亮比例强行移动象限。

10实验记录模板

另保存FCS、单染直方图、门控截图、细胞计数、对照设置、仪器QC及操作者。

11常见问题与排错

阴性组PI阳性偏多

可能为消化时间长、离心吸打太猛、细胞过度融合/死亡或未及时检测。保留漂浮细胞并优化前处理；检查细胞状态而非仅调门。

Annexin整体偏低或无信号

确认用的是Alexa Fluor 488偶联物、结合液含钙、染料保存正确、488激发与绿通道匹配，并确认阳性样本真的有效。

单染补偿不稳

使用同一染料批次和相近亮度的单染细胞/合适补偿材料；检查阳性与阴性是否都在范围内、是否饱和。不要直接抄其他实验的补偿矩阵。

图上象限比例忽高忽低

查看事件时间图、采集流速、细胞团块、处理到采集间隔和回收细胞方案。固定门后重算所有样本。

12参考资料

• Thermo Fisher, *Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide User Guide*, Rev A.0 (2022), physical p.2; 本文限定该偶联物和结合液。
• 本站原创图解；图内和图注中的演示数值均为“教学模拟，非实验数据”。完整参数核对见 beginner-source-review.md。