BCA 蛋白定量：25 μL 微孔板法与标准曲线

02实验原理

BCA通过蛋白参与的铜离子反应形成紫色产物，562 nm吸光度对应相同条件下的BSA标准。它测得的是相对于BSA的总蛋白估计，不直接报告目标蛋白浓度。样本、空白和标准必须一起显色、冷却与读取。

04材料与仪器

• Pierce #23225的Reagent A/B、2 mg/mL BSA标准；BSA储备液预先配在与样本相同的RIPA中。
• 两份未加还原上样液的细胞裂解物、同批RIPA、透明平底96孔板。
• 37°C孵育设备、可读562 nm的酶标仪、移液器、过滤枪头、板盖。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

核对RIPA与BCA兼容，不使用已加还原剂的WB样本。六点标准双孔12孔，两未知样本双孔4孔，共16孔。标准基质与样本不同会造成系统偏差；若手中BSA为盐水标准，应先验证基质效应或准备匹配标准，不能把缓冲差异忽略为蛋白差异。检查标准和工作液无沉淀，仪器预设562 nm。

08逐步操作

1. 标记六个标准管为0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL，另标样本A/B稀释管；在板图列明每个双孔位置。
2. 按配方表分别加BSA储备液和RIPA至200 μL，轻吹打8次混匀。最高点不加稀释液，零点仅有同RIPA。
3. 给A/B分别加48 μL RIPA，再各加12 μL对应裂解物，吹打8次。记清1:5是总体积60 μL除以原样12 μL。
4. 将各标准及样本分别加25 μL到对应双孔，每换一个来源换枪头，避免枪头碰孔底后带回标准管。
5. 在新管混合A3500 μL、B70 μL，轻轻颠倒至澄清绿色。刚混合短暂混浊可消失，持续沉淀时暂停检查试剂。
6. 向16孔各加200 μL工作液，以相同顺序加液并记录起止时间；不要向标准孔和样本孔加入不同体积。

   

7. 加板盖，在板振荡器混合30秒；检查无明显气泡。气泡遮光时用洁净枪头处理，不吸走已知量反应液。
8. 将板37°C孵育30分钟，标准和样本同板同位置条件处理，不将一部分孔先放室温反应一小时。
9. 取出冷回室温，按一致等待时间读取562 nm全板吸光度，保存原始孔值及板图，不能只保存软件给出的浓度。
10. 用零蛋白双孔的均值扣背景，检查双孔一致性及标准随浓度单调增加；采用适合本曲线的二次或分段拟合，勿强迫高浓度端过原点直线。
11. 由标准曲线求未知稀释液浓度，再乘5得到原样浓度。例如孔测为0.30 mg/mL，则原样1.50 mg/mL，即1.50 μg/μL。
12. 超过2 mg/mL曲线顶端的稀释样本应进一步稀释重测；低于有效范围则减少稀释或换适用方法。双孔明显不符先查气泡、漏加与污染，不能挑一个值。
13. 计算后续上样量：若需10 μg、原样1.50 μg/μL，取6.67 μL。签名保存标准曲线、稀释倍数和计算，未用裂解物冰上短存或分装−80°C。

09结果判断与质控

合格结果需要可解释的标准曲线、空白稳定、双孔一致且未知落在曲线范围。可预设双孔CV≤10%为本次教学检查线；接近空白时CV不稳定，不单靠该数值判定。BCA显色不是严格终点反应，因此同批相同时间比额外增加读数位数更重要。

10实验记录模板

11常见问题与排错

全板背景高

检查零点基质和样本是否含DTT、β-巯基乙醇或还原性添加物；换兼容方法比从异常值强行扣背景更可靠。

标准不单调

复核储备浓度、顺序及加液，重新配标准；不能删掉不合预期的点后照常报告。

重复偏差大

查混匀、气泡、板边蒸发和加液时差，重做受影响孔。

12参考资料

• Pierce BCA官方手册 MAN0011430：已核对25 μL样本、200 μL工作液、A:B=50:1、37°C30分钟和562 nm。本文六点标准和CV检查线为教学设计。