琼脂糖切胶回收：100 mg胶块的GeneJET示例

02实验原理

切取目标区域减少非特异片段，结合液溶胶并促进DNA吸附硅胶膜。胶块越大需处理盐和琼脂糖越多，不能为了“多收一点”无界扩大切块。目标长度估计、胶块质量和洗脱总量均需保存。

04材料与仪器

• K0691、乙醇、必要时3 M醋酸钠pH5.2、预先称重的1.5 mL管。
• 已有目标条带的1%胶、兼容防护光源、洁净刀片/镊子、毫克可读天平。
• 56°C加热块、13000×g离心机、移液器、DNA定量和分析电泳条件。

05配液与用量

06时间安排

07开始前的准备

预称空管并记录质量，核对胶浓度为1%、目标约1 kb且相邻条带可分开。先备好洗液和刀片再打开光源，避免边找工具边持续照射DNA。若目标与杂带重叠，先重新优化电泳分离，不能凭想象在同一胶块中挑出正确序列。

08逐步操作

1. 用完整胶图和ladder标明目标泳道、约1 kb位置及样本号，保留切胶前图，不只拍裁下来的胶块。
2. 在允许的低损伤光源下用洁净刀片紧贴目标带切取，避开相邻带及多余胶。每个样本换刀片或用经验证方式去污，关闭不用的光源。
3. 把胶块移入预称重管，重新称重，以差值算胶重；示例净100 mg，记录实测而非一律写100 mg。
4. 按1 μL结合液/mg胶加入：100 mg加100 μL，200 mg加200 μL。1%胶不得误套其他产品3倍胶体积配方。
5. 56°C加热约10分钟，每隔2–3分钟颠倒混匀，直到完全无透明固体；仍有胶块时继续短时观察，不带未溶胶上柱。
6. 短涡旋混匀后查看颜色。应为黄，橙/紫时加10 μL 3 M醋酸钠pH5.2混匀，仍不正常先查pH与试剂，不无记录反复添加。
7. 将本例约200 μL溶胶混液上柱，室温13000×g离心1分钟，弃流出液；一次不超过800 μL，总胶不超过1 g/柱。
8. 本例拟送测序，另向柱加100 μL Binding Buffer，13000×g离心1分钟后弃流出。若用途不需该步骤，应在记录注明，不随意改成任意洗液。
9. 加700 μL已加乙醇的工作洗液，13000×g离心1分钟，倒尽流出液，将柱放回。
10. 空柱13000×g再离心1分钟以去乙醇，换到干净标记管；省略此步可能导致回收DNA不能用于后续酶反应。
11. 膜中央加50 μL Elution Buffer，13000×g离心1分钟，收集洗脱液。枪头不接触膜，记录实际洗脱体积。
12. 用同缓冲液作空白测双链DNA浓度，计算总ng。取2 μL回收物与8 μL水、2 μL 6×loading dye混合，取10 μL分析电泳，带ladder检查片段大小和残留杂带。
13. 合格后按浓度和总量准备下游反应，较长保存分装−20°C；若发生长时间UV暴露或目标胶块混入杂带，记录风险，必要时重跑重切。

09结果判断与质控

应得到约1 kb主要DNA片段、可测总量且下游用途所需质量足够。切胶不保证序列正确，也不能修复光照损伤。不要把厂商“最高回收率”写成本次实际回收率；只有输入质量可可靠估计时才报告该值。

10实验记录模板

11常见问题与排错

柱堵或回收低

检查未溶胶、胶块过大及乙醇是否已加；降低胶量并重做，不盲目提升离心力。

回收后仍多条带

切取区域可能含相邻片段，需改善前序分离和切取，柱子不会再次分选长度。

测序/连接失败

检查盐/乙醇、DNA量和光照损伤；不能通过延长曝光证明样本完好。

12参考资料

• GeneJET Gel Extraction MAN0012661 Rev.B：已核对1:1胶重/体积、50–60°C溶胶、颜色处理、测序用追加结合、700 μL洗液、50 μL洗脱及离心要求。